免疫亲和色谱与分子印迹技术(二)

早期，人们曾使用纤维素作为免疫亲和色谱的固相基质，其较差的耐压性导致柱流动性差而未被继续使用。现在常用的载体有琼脂糖凝胶、多孔玻璃、高分子涂层硅胶、聚丙烯酰胺凝胶等。

3、免疫亲和色谱固相基质的活化与耦联

大部分免疫亲和色谱固相基质在与配体(如--抗体)共价耦联之前，均需要进行活化。为了使配体能够突出于固相基质表面，可以在配体和固相基质之间引入一个“间隔臂”，如可利用戊二醛的两个醛基分别与基质和配体共价连接。通常配体与基质的耦联方法是先在基质骨架上引入亲电基团，再与“间隔臂”或抗体上的亲核基团(如-NH₂、-OH、-COOH等)共价结合。

在小配体的免疫亲和色谱中，需要在基质和配体之间插一个“间隔臂”，以减少空间位阻的影响。在农药残留免疫亲和色谱中，配体是抗农药抗体，分子大，目标分析农药与抗体的结合一般不会受空间位阻的影响。相反，“间隔臂”的引入、特别是疏水性“间隔臂”的引入反而增加了非特异性吸附的机会。

CNB_r法最早由Axen等(1967)提出，属经典的活化方法，具有方法简单、活化效果好特点，但是本法有操作CNBr的危险，特别是该法引入了阴离子交换基团异脲衍生物(pK_a=10.4)，成为CNBr活化基质增加非特异性吸附的重要原因。CNBr法制备的免疫亲和色谱固定相在使用过程可能发生抗体的流失问题。

Bethell等(1979)建立了目前被认为最优良的羰基二咪唑(carbonyldimidazole，CDI活化法。羰基二咪唑法活化与耦联反应的产物只有一个，即N-取代氨基甲酸酯衍生物，反应过程较CNBr简单，活化效率较CNBr法高数十倍，与抗体的耦联率可与CNBr法相媲美。

抗体与活化基质的耦联分为随机耦联与定向耦联两种方式。

所谓随机耦联，就是指将活化好的基质耦联在纯化抗体的不确定部位。随机耦联存在着一些问题：①基质与抗体耦联时，抗体的定位不准确，抗原结合位点容易被占，导致抗体的免疫学活性降低或丧失；②抗体与基质多点结合，使空间位阻加大，阻碍抗原接近结合位点。所以随机耦联后抗体的活性一般仅为游离抗体的1％～30％。

所谓定向耦联，就是选择性地将抗体的非抗原结合部位与固相基质共价耦联。目前，基质与抗体定向耦联方法主要有3种。①先将蛋白A或蛋白G固定在固相基质上，然后再与多抗(或单抗)相结合。因为蛋白A或蛋白G与IgG有很强的亲和力且只与抗体的非抗原结合部位(IgG的恒定区)结合，从而可使抗体的抗原结合位点游离。该法的缺点是蛋白A或蛋白G与抗体的结合是非共价结合，作为配体的抗体在色谱过程中容易受条件影响而流失。②先将抗体或抗体F舳片段用13一巯基乙醇还原，使抗体的铰链区打开，生成自由的巯基，然后与含碘乙酰基团的基质反应，形成稳定的硫醚键而耦联于基质上。抗体的抗原结合部位不含巯基，耦联后不影响抗体的抗原结合部位，但还原后的抗体其稳定性会受到一定影响。③将抗体恒定区糖类中的羟基在温和条件下用高碘酸盐氧化，或将末端半乳糖残基与半乳糖氧化酶反应，形成醛基后与含酰肼的基质耦联。定向耦联的优点是不影响抗体的抗原结合位点，可保持抗体的高免疫学活性，提高免疫亲和色谱柱的亲和容量。

4、免疫亲和色谱柱的制备

将抗体与固相基质的耦联物(免疫亲和色谱固定相或称为免疫吸附剂)加在适当缓冲液中，轻轻摇匀后加至底部有筛板的玻璃柱或聚乙烯柱中，让免疫吸附剂自然沉降，打开柱出口，用缓冲液平衡后关闭柱出口。

5、免疫亲和色谱柱性能评价与免疫亲和色谱条件的选择

(1)免疫亲和色谱柱容量的测定：柱容量是免疫亲和色谱中具有重要实用价值的参数，分为动态柱容量(μg/mL柱床)和绝对柱容量(μg/mg IgG)。在免疫亲和色谱条件已经确定的情况下，测定柱容量最方便的方法是将一定浓度、超过理论容量的目标分析物溶液通过免疫亲和色谱柱，待柱饱和(出柱浓度与人柱浓度相同)后，洗涤去除柱内游离物，用适当溶剂完全洗脱目标分析物，测定其含量，从而可计算出柱容量。免疫亲和色谱柱在使用和储存过程中应定期检测柱容量的变化。

(2)吸附与洗涤介质的选择：将一系列不同pH、不同离子强度及不同化学组成的缓冲液分别用作平衡免疫亲和色谱柱、分离富集目标分析物和洗涤免疫亲和色谱柱的流动相，测定不同条件下的柱容量，选择柱容量最大的缓冲液作为平衡免疫亲和色谱柱、分离富集目标分析物和洗涤免疫亲和色谱柱的流动相。

(3)洗脱条件的选择：免疫亲和色谱柱中的目标分析物的洗脱可采用不同方法，如改变缓冲液的pH、离子强度、极性，或使用变性剂(脲、胍等)、去垢剂和离子序列高的离子配制洗脱剂。对于农药小分子，常采用在缓冲液中加入适当能与水互融的有机溶剂(如甲醇等)作洗脱剂，洗脱液可直接用于高效液相色谱仪或气相色谱仪分析。在样品提取液中杂质含量高的情况下，为了提高免疫亲和色谱的效率，有时需要在免疫亲和色谱分离净化和富集前适当增加净化步骤，以去除样品提取液中的大量杂质。

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