检测食品中胭脂虫红的处理方法及波长选择的研究（一）

胭脂虫红色素是一种蒽醌类天然色素，寄生在仙人掌类植物上的雌性胭脂虫是提取胭脂虫红色素的原料，此种胭脂虫原产于中南美洲、墨西哥等地。20世纪90年代，我国首次从国外引进胭脂虫，2002年在云南省开始有规划种植胭脂虫。目前国际国内市场上的胭脂虫红产品主要分为三种：胭脂虫萃取液、胭脂虫红铝、水溶性胭脂虫红色素。胭脂虫红色素的主要成分是胭脂红酸，胭脂红酸呈极性，易溶于水以及甲醇、乙醇等有机溶剂，136℃会分解，光稳定性较好。

胭脂虫红色素因其安全的特性及美丽的颜色被广泛应用于食品。国家标准GB2760-2014中对胭脂虫红的使用限量（以胭脂红酸计）进行了要求。目前国内外主要使用分光光度法来测定食品中胭脂虫红的含量，检测波长在可见光区494nm，此方法不能排除其他在494nm下有吸收的杂质组分的干扰。随着研究的深入，反相薄层色谱（TLC）/光密度扫描分析法、高效毛细管电泳法、液相色谱法和超高效液相色谱-质谱联用法等方法被逐渐应用于胭脂虫红的测定。由于胭脂红酸在紫外光区和可见光区均有明显的吸收峰，本研究建立了高效液相色谱法，分别在两个光区选择最大吸收波长进行检测，并对检测结果进行比较，为胭脂虫红的测定提供更精准的方法。同时，针对部分含干扰物质较少的样品，从前处理方法和检测波长两方面进行摸索，建立了快速检测胭脂虫红的方法。

一、实验部分

1、仪器与试剂

高效液相色谱仪（美国Agilent，1260Infinity）；分析天平（德国Sartorius，QUINTIX224-1CN）l离心机（德国Sigma，4-16KS）；恒温水浴锅（上海精宏，DKZ-2）；旋涡振荡器（德国IKA，MS3）；聚酰胺固相萃取小柱（上海安谱，60mg/3mL）。

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。胭脂红酸（CAS：1260-17-9，德国Dr.EhrenstorferGmbH）l乙腈（德国Merck，色谱纯）；甲酸（德国Merck，色谱纯）。0.05％甲酸水溶液；2mol/L盐酸溶液；酸化甲醇（甲酸：甲醇=1:50，v:v）；氨水甲醇（体积分数为5％的氨水:甲醇=1:l，v:v），以上试剂均为广州化学试剂厂。

2、标准溶液的配制

准确称取胭脂红酸标准品0.1g（精确至0.0001g）于100mL容量瓶中，用水溶解定容，配制成质量浓度为1000mg/L的储备液。移取适量标准储备液，以水稀释成质量浓度分别为2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、100mg/L系列标准溶液。

3、样品的前处理

（1）直接提取法

称取2g均匀后样品于50mL离心管中，之后加入2mol/L盐酸溶液10mL，混合均匀，置于80℃水浴中30min，取出充分冷却后加入15mL甲醇，振荡2min。于9000r/min转速下离心5min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤后，按色谱条件进行测定。

（2）净化法

处理方法：称取2g均匀后样品于50mL离心管中，之后加入2mol/L盐酸溶液10mL，混合均匀，置于80℃水浴中30min，取出充分冷却后加入15mL甲醇，振荡2min。于9000r/min转速下离心5min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤后，按色谱条件进行测定，待净化。取上清液5mL于15mL离心管中，加入5mL水充分混匀。用2mL酸化甲醇和2mL水活化聚酰胺固相萃取小柱，将混合液以流速1～2mL/min全部过柱，用2mL水淋洗并抽干，之后用2mL的氨水甲醇洗脱，并用15mL刻度管收集，再加入300μL甲酸，用水定容至2.50mL，混匀后用0.22μm滤膜过滤，按色谱条件进行测定。

4、色谱条件

（a）色谱柱：Agilent5TC-C185μm×4.6mm×150mm；

（b）柱温：35℃

（c）进样量：20μL；

（d）检测波长：276nm和494nm；

（e）流速：1.0mL/min；

（f）流动相：A：0.05％甲酸水溶液；B：乙腈；梯度洗脱程序见表1。

二、结果与讨论

1、检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对胭脂红酸标准溶液在190nm～600nm范围进行吸收光谱扫描，结果见图1。观察发现胭脂红酸的最大吸收波长为276nm和494nm，本研究同时选择276nm和494nm为检测波长。

2、标准曲线的绘制与检出限

以胭脂红酸溶液的质量浓度为横坐标，以在两种波长下测得的峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，求得回归方程。在276nm检测波长下，得到的线性回归方程为y=73.23551x-19.78479，相关系数r=0.99998；在494nm检测波长下，得到的线性回归方程为y=18.64641x+0.0428828，相关系数r=0.99997。两者在2.5～100mg/L范围内均具有良好的线性关系。直接提取法，以取样量2g计，在494nm检测波长下的检出限为10.0mg/kg（S/N＞3）；净化法，以取样量2g计，在276nm检测波长下的检出限为1.25mg/kg（S/N＞3），在494nm检测波长下的检出限为3.75mg/kg（S/N＞3）。

3、精密度实验

将浓度为20mg/L的胭脂红酸标准液连续进样6次，评估仪器的精密度，结果见表2。由表2可看出，在276nm检测波长下，标准液实测值为19.5mg/L，RSD为0.49％；494nm波长下，实测值为19.4mg/L，RSD为0.76％。

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