荷叶总黄酮提取工艺及其抗氧化性研究（一）

荷叶属睡莲科植物莲的叶片，是国家卫生部公布的既是食品又是药品的植物。荷叶中富含多种具有生物活性的成分，如荷叶精油、荷叶生物碱、荷叶多糖及荷叶黄酮等，其中荷叶黄酮是其主要活性物质。报道显示，黄酮类化合物对治疗血管病有很好的效果，具有抗氧化、稳固血管、疏通血管、防止高龄人的血压疾病等功效，对身体代谢和人体免疫也有重要作用。所以，针对影响荷叶总黄酮提取的因素进行研究，选择优良的提取工艺，提高荷叶总黄酮的提取率，研究其总黄酮抗氧化性，对人体健康保护具有重要意义。

1.实验部分

1.1试剂与仪器

荷叶样品，河北衡水湖；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸亚铁、H2O2、水杨酸，均为分析纯；芦丁对照品，含量98.7%，化学标准品，上海金穗生物科技有限公司。722型可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；FA2004B型电子天平，上海衡平仪器仪表厂；FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；80-2型高速离心机，金坛市国旺实验仪器厂；BL6-180A型超声波清洗机，上海碧浪仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵，郑州长盛实验仪器有限公司；GZH-DH-X型电热恒温干燥箱，郑州宏朗仪器设备有限公司。

1.2薄荷叶总黄酮提取的单因素实验

将风干的荷叶置于干燥的粉碎机，粉碎4min后，过60目分样筛，得到所需荷叶样品，储存于密封容器中，待用。

荷叶中总黄酮的提取流程：预处理后的荷叶粉→加入乙醇→超声提取→冷却至室温→离心→收集上清液→测吸光度→计算黄酮含量。

1.2.1料液比对总黄酮提取率的影响

准备75%乙醇溶液，电子天平称量1.00g处理备用的荷叶粉末，依据料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14分别混合，实验时间25min，温度45℃，进行总黄酮提取。然后将得到的提取液离心分离15min（转速5000r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25mL，取1mL清液进行黄酮含量测定。

1.2.2实验温度对总黄酮提取率的影响

准备75%乙醇溶液，用电子天平称量1.00g处理备用的荷叶粉末，依据料液比1∶10混合，实验时间为25min，分别在温度为25℃、35℃、45℃、55℃和65℃的实验条件下提取总黄酮。然后将得到的提取液离心分离15min（转速为5000r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25mL，取1.00mL清液进行黄酮含量测定。

1.2.3不同乙醇浓度对提取总黄酮提取率的影响

用电子天平称量1.00g处理备用的荷叶粉末，依据料液比1∶10，加入不同浓度（45%、55%、65%、75%、85%）的乙醇，实验时间为25min，温度45℃，进行总黄酮提取。然后将得到提取液离心分离15min（转速为5000r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25mL，取1.00mL清液进行黄酮含量测定。

1.2.4超声时间对总黄酮提取率的影响

准备75%乙醇溶液，用电子天平称量1.00g处理备用的荷叶粉末，依据料液比1∶10混合，超声温度45℃，超声提取时间分别为15min、30min、45min、60min、75min。然后将得到提取液离心分离15min（转速为5000r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25mL，取1.00mL清液进行黄酮含量测定。

1.3正交实验

综合以上的单因素实验再次进行正交实验，以确定提取荷叶总黄酮的最佳实验方案。正交因素水平表见表1。

1.4总黄酮含量测定

1.4.1标准曲线的绘制

将10mg芦丁溶于75%乙醇中，小幅度地摇晃，静置后使用蒸馏水定容至10mL，得到浓度为1mg/mL的芦丁标准品溶液。取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL芦丁溶液放入20mL比色管中，量取1.0mL浓度为5%NaNO₂溶液，加入试管，摇匀后静置8min；量取1.0mL浓度为10%的Al（NO₃）₃溶液，加入比色管，轻晃后放置8min；量取10.0mL浓度为5%的氢氧化钠溶液，加入比色管；向比色管中加入75%的乙醇至20mL，轻晃，静置18min。510nm处测定各溶液的吸光度，做出芦丁标准曲线。

1.4.2黄酮含量的计算

准确量1.2所得的清液1.0mL，按以上步骤在510nm的位置检测其吸光度值。依照标准曲线，求出对应的黄酮浓度，依照公式计算黄酮含量。

黄酮含量（g/100g）=a×c×V/10W

（c，V，W为实验原始数据）

式中：a-稀释倍数；c-黄酮浓度，mg/mL；V-提取液总体积，mL；W-甘草粉质量，g。

1.5荷叶总黄酮的抗氧化性

1.5.1对DPPH自由基的清除能力

（1）配制所需浓度的DPPH溶液

用95%乙醇溶液对0.0112g的DPPH进行溶解；将上述溶液加入到50mL容量瓶中，加入95%乙醇溶液定容。

（2）测试DPPH自由基本身的吸光值Ac

取配好的DPPH溶液2.00mL于试管中；移取2.00mL的蒸馏水加入比色管，定容，轻晃，阴暗处静置18min；测定溶液在510nm位置的吸光值Ac。测试3次，取均值。

（3）测定加入黄酮后溶液的吸光值A_i

将不同浓度的样品溶液2.00mL用移液管移至试管中；取配好的DPPH溶液2.00mL，加入比色管，定容，轻晃，背光处放置18min；测定510nm处的吸光值A_i。重复进行3次，取平均值。

（4）测试黄酮本身的吸光值A_j

分别将不同浓度的样品溶液用移液管移取2.0mL至不同试管中；量取2.0mL蒸馏水放入比色管，定容，轻晃，阴暗处放置18min；测定510nm处的吸光值A_j。重复进行3次，取平均值。相同步骤测定相同浓度VC标准液的清除能力为对照。

（5）计算DPPH·清除率：

1.5.2对羟自由基（·OH）的清除作用

1.5.2.1测试羟自由基本身的吸光值D

（1）量取2.00mL蒸馏水放入比色管。

（2）量取2.00mL浓度为6mmol/L的FeSO₄溶液，加入比色管后摇匀，放置15min。

（3）量取2.00mL浓度为6mmol/L的水杨酸，加入比色管后摇匀，放置15min。

（4）量取2.00mLH₂O₂溶液，加入比色管摇匀，放置15min。

（5）测出溶液在510nm下的吸光度值，记为D。

量取2.00mL蒸馏水放入比色管，测定将荷叶黄酮提取液加入到羟自由基后溶液的吸光值D_i，量取2.00mL浓度为6mmol/L的FeSO₄溶液，加入比色管后摇匀，放置15min，量取2.00mL浓度为6mmol/L的水杨酸，加入比色管后摇匀，放置15min，量取2.00mLH₂O₂溶液，加入比色管摇匀，放置15min，测出溶液在510nm下的吸光度值，记为D。

1.5.2.3测试不同浓度荷叶提取液本身的吸光值D_j

1.5.2.4相同步骤配制相同浓度的VC标准液为对照

1.5.2.5计算羟自由基的清除率

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