冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质的研制 （一）

目的研制冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质，作为量值传递的标准。方法参照JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》和JJF 1644—2017《临床酶学标准物质的研制》要求进行均匀性、稳定性、互换性评价；联合6家通过中国合格评定国家认可委员会（CNAS）认可的校准实验室对标准物质进行定值，评定其均匀性、稳定性和定值引入的不确定度，计算扩展不确定度。结果标准物质均匀性和稳定性均良好，互通性评价结果显示，4个常规检测系统的测量值均位于95%可信区间内。定值结果：水平1为（106.3±4.3）U/L(k=2)，水平2为（268.1±7.9）U/L(k=2)。结论研制的冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质标示值可靠，均匀性、稳定性较好，具有互换性。

血清、尿液α-淀粉酶测量是临床上最常用的实验室检测指标之一，在胰腺疾病，特别是急性胰腺炎的诊断、疗效观察中具有重要作用。淀粉酶是急性胰腺炎早期诊断指标，为解决临床检验血清淀粉酶测量结果的正确性，实现测量结果的可溯源性和临床检验结果可比、互认，减少重复检查，减轻患者负担，本实验室制备了2个水平的冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质。

1材料和方法

1.1仪器与试剂

cobas 8000全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂、校准品和质控品，U-3310分光光度计（日本日立公司）。参考方法试剂：N-2-羟基乙基哌嗪-N'-乙基磺酸（批号为017K5410，美国Sigma公司），4,6-亚乙基-4-硝基苯-α-（1->4)-D-麦芽七糖（批号为121214A，北京阿匹斯公司）。有证参考物质IRMM/IFCC-456（欧盟参考物质和测量研究中心）。

1.2标准物质样本制备

选择外观清亮，无脂血、黄疸和溶血的样本。乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋体抗体、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体检测阴性。经2次除菌过滤后，分装至无菌收集管中，每支1 m L，共300支。制备了2个水平的标准物质，可-70℃冰箱保存。

1.3标准物质评价

按照JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》和JJF 1644—2017《临床酶学标准物质的研制》要求进行均匀性、稳定性、互换性评价，所有样本均采用cobas 8000全自动生化分析仪测量。

1.3.1均匀性检验

取15支样本，在1个批次内完成测量，每支样本重复测量3次。结果采用单因素方差分析进行评价。方差分析结果中的组间方差MSamong>组内方差MSwithin时，样本间均匀性的标准偏差sbb计算公式为：

式中ubb,rel为α-淀粉酶由于样本不均匀性引入的不确定度分量。

1.3.2稳定性评价

采用同步稳定性进行评估，结果采用回归分析的t检验进行评价，基本模型为：Y=β0+β1X，式中β1、β0为回归系数，X为时间，Y为标准物质的特性值。（1）短期稳定性评价。评价运输对标准物质待定特性值的影响。分别于第1、2、3天从冰箱中取出样本，放入干冰冷冻包装箱，与第5天从储存冰箱中取出的样本同时进行测量。每个水平1个监测点抽取2支样本，4个监测点合计8支样本。在1个批次内完成测量，每支样本重复测量3次。（2）长期稳定性评价。评价标准物质-70℃保存1年的稳定性。分别于第0、7、31、90、182天从-70℃冰箱中取出样本，放入液氮瓶中，与第365天从-70℃冰箱中取出的样本同时进行测量。每个水平1个监测点抽取3支样本，共6个监测点，合计18支样本，在1个批次内完成测量，每支样本重复测量3次。（3）使用时稳定性评价。评价标准物质使用时储存于冰箱（2～8℃）或室温（20～25℃）的稳定性。分别于24、6、4、2 h从-70℃冰箱中取出4支样本，冰箱或室温各放置2支，与测量前从-70℃冰箱中取出的样本同时进行测量。每个水平1个监测点抽取4支样本，冰箱或室温环境各放置2支，进行稳定性检验，共5个监测点，合计20支样本。在1个批次内完成测量，每支样本重复测量3次。（4）稳定性引入的不确定度。由稳定性引入的不确定度计算公式为：us=s（β1）×X，式中us为由稳定性引入的不确定度，s（β1）为β1的标准偏差，X为给定的保存期限。

1.3.3互换性评价

互换性采用最小二乘法进行线性回归分析。（1）参比检测系统。实验室参照2006年国际检验医学溯源性联合委员会推荐的α-淀粉酶参考测量程序（37℃）建立一级参考方法。（2）临床评价检测系统。系统1：瑞士罗氏公司cobas 8000全自动生化分析仪及配套试剂（AMY384295）、校准品（cfas,lot:305596）和测量程序；系统2：美国贝克曼库尔特公司A U 5 8 0 0全自动生化分析仪及配套试剂（AMY6159）、校准品（lot:F6662）和测量程序；系统3：瑞士罗氏公司cobas 8000全自动生化分析仪、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司试剂（AMY142819001）、校准品（059318006）和测量程序；系统4：瑞士罗氏公司cobas 8000全自动生化分析仪、四川迈克生物股份有限公司试剂（AMY0518061）、校准品（Lot:366059）和测量程序。（3）样本。共20份新鲜单供体人血清样本，浓度范围覆盖标准物质浓度范围，每个样本重复测量2次。

1.4定值

1.4.1定值方法

定值依据参考文献进行（同参比检测系统）。2个水平的标准物质每日分别测量3次，连续测量3 d，共9个测量结果。

1.4.2定值方式

由6家通过中国合格评定国家认可委员会认可的参考（校准）实验室联合定值。

1.4.3定值及其引入的不确定度计算

根据测定数据服从正态分布状态，组间数据是否为等精度进行计算。

1.4.4结果检验

采用Shapiro-Wilk进行正态分布检验，采用格拉布斯（Grubbs）法进行组内可疑值检验和各组数据平均值显著性检验，组间数据等精度检验采用科克伦（Cochran）法。

1.4.5标准值的不确定度评定

标准物质的合成标准不确定度（uCRM）计算公式为：

式中ub b为由甁间不均匀性引入的标准不确定度，ults为由长期（1年）不稳定性引入的标准不确定度，usts为由短期不稳定性引入的标准不确定度，uchar为由定值引入的标准不确定度。扩展不确定度（UCRM）按照公式：UCRM=合成标准不确定度（uCRM）×κ计算，式中κ为包含因子，此处κ=2（置信水平为95%）。

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