Copine-3-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白在细胞中的表达和定位（一）

Copines蛋白家族是一类Ca2+依赖磷脂结合蛋白，分布广泛且进化保守。该家族成员在结构上具有相同特征:N末端有两个与已知的Ca2+依赖磷脂结合C2结构域高度相似的C2结构域;C末端有1个与整合蛋白(integrin)胞外区的A结构域具有同源性的A结构域。目前在哺乳动物中已发现8个该蛋白家族成员，分别为Copine-1～Copine-8(基因名CPNE1～CPNE8)。

Copine-1蛋白是最先被发现的。Yoo等通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低Copine-1蛋白表达能够抑制人骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。研究发现，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可以上调内源性Copine-1蛋白的表达，且TNF-α信号传导途径对毒蕈碱刺激的反应随着Copine-1表达的增加而增强;Copine-1蛋白还可以增强核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa-B，ⅠκB)的TNF-α依赖性降解。此外，Copine-1蛋白与p65相互作用能够消除核因子κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)的转录。Copine-6蛋白主要在神经元中表达，研究表明，Copine-6蛋白在癫痫脑组织中的异常表达可能与难治性癫痫有重要联系。Copine-7蛋白是一种成神经细胞衍生因子，能够调节间充质干细胞的成牙本质细胞分化和正向调控牙本质唾液磷蛋白表达。Copine-8蛋白可能是一个抑制急性髓性白血病癌细胞增殖的因子。

Copine-3蛋白与Copine-1蛋白的氨基酸序列同源性高达63%，其在人体的脑、肺、心脏、肾脏组织中均有表达。Caudell等发现，内源性Copine-3蛋白和外源表达的重组Copine-3蛋白均可使外源髓鞘磷脂碱性蛋白磷酸化，然而，Copine-3蛋白氨基酸序列中缺少已知的激酶催化结构域，这些研究提示，Copine-3蛋白可能具有内在的激酶活性。研究发现，Copine-3蛋白的高表达与急性骨髓性白血病的不良预后有关。Tan等研究发现，与患有慢性冠状动脉疾病的患者相比，急性心肌梗死患者的外周血中Copine-3蛋白的表达量更低，表明CPNE3基因的低表达是发生急性心肌梗死的潜在危险因素。综上所述，Copine-3蛋白在人体组织中广泛表达，但其在细胞中的功能尚不明确。

本研究利用增强型绿色荧光蛋白(plasmid enhanced green fluorescent protein,p EGFP)-N1构建重组真核表达载体，脂质体转染人胚肾上皮细胞293T、肺腺癌细胞H1299，瞬时表达Copine-3-EGFP融合蛋白，观察并检测Copine-3蛋白在细胞中的定位，为进一步研究其生物学功能提供基础。

材料和方法

1．主要试剂和仪器

DMEM培养基、10%胎牛血清(FBS)、OptiMEMTMⅠ培养基购自Gibco公司;107IU/L青霉素+10 g/L链霉素(双抗)、0.25%胰蛋白酶细胞消化液购自索莱宝科技有限公司;LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent转染试剂、Pro LongTM Gold Antifade Mountant with DAPI封片剂、Copine-3抗体(兔抗人Ig G,2.63 g/L)和罗丹明标记的山羊抗兔Ig G二抗(1.5 g/L)购自Invitrogen公司;DNA分子量标准、Prime STAR HS DNA Polymerase、XhoⅠ和Bam HⅠ限制性内切酶以及High Fidelity Prime ScriptTMRT-PCR Kit购自Ta KaRa公司;总RNA提取、质粒提取、DNA纯化试剂盒以及T4连接酶购自天根生化科技(北京)有限公司;GAPDH抗体(兔抗人Ig G,1 g/L)、β-acting抗体(兔抗人Ig G,1 g/L)购自Affinity公司;Histone H1抗体(鼠抗人Ig G,200 mg/L,Santa公司);HRP标记的山羊抗兔Ig G二抗(1 g/L)和HRP标记的山羊抗鼠Ig G二抗(1 g/L)购自Bioworld公司;细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;PVDF膜(Bio-Rad公司);引物合成和DNA测序由英潍捷基上海贸易有限公司完成;GTVisionⅢ型免疫组织化学检测试剂盒购自基因科技(上海)股份有限公司，肺腺癌组织芯片(HLug A030PG03)购自上海芯超生物科技有限公司。

CO2细胞培养箱(Thermo公司);小型高速冷冻离心机(Eppendorf公司);蛋白电泳仪(Bio-Rad公司);Western转印仪(Hoefer公司);荧光倒置显微镜、激光扫描共焦显微镜(Leica公司)。

2. 实验方法

2.1 细胞总RNA的提取及反转录:

人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)接种于6孔板中，用含双抗和10%FBS的DMEM培养至90%汇合。细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，500 r/min离心5 min收集。按天根生化科技(北京)有限公司总RNA提取试剂盒(DP419)说明书操作进行细胞总RNA的提取。将提取到的细胞总RNA，按High Fidelity Primer ScriptTMRT-PCR Kit试剂盒说明书操作，反转录获得c DNA。

2.2 人CPNE3基因的扩增:

根据CPNE3基因编码序列(片段全长1613 bp)，设计合成上游引物5’-A C G T C T C G A G A T G G C T G C C C A G T G T G T C A C AA-3’和下游引物5’-A C G TGGATC C GC C TGC TTC TG T T G T T T C G T G G CT-3’，上、下游引物分别加入XhoⅠ、Bam HⅠ酶切位点(下划线为酶切位点序列)。以c DNA为模版，PCR扩增CPNE3基因编码序列，反应条件为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸2 min，循环30次，72℃延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，胶回收与目的片段大小相同的DNA条带。

2.3 重组质粒p EGFP-N1-CPNE3的构建:

将p EGFP-N1质粒和CPNE3基因PCR产物，分别用XhoⅠ和Bam HⅠ，在37℃下酶切1 h，胶回收纯化酶切产物，并用T4 DNA连接酶16℃连接过夜。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，利用卡那霉素抗性筛选阳性集落，并抽提质粒进行双酶切验证。将筛选到的阳性集落送测序。将测序正确的阳性集落接种于含卡那霉素的LB培养基中过夜培养，收集菌体，按高纯度质粒小提中量试剂盒说明书操作提取质粒，用于后续细胞转染。

2.4 重组质粒转染细胞:

293T和H1299细胞常规培养于含双抗和10%FBS的DMEM培养基，消化并接种6孔板。待细胞生长至60%汇合时，按LipofectamineLTX with PlusTMReagent转染说明，进行p EGFP-N1质粒和p EGFP-N1-CPNE3重组质粒的转染。

2.5 细胞爬片:

293T和H1299细胞常规培养于含双抗和10%FBS的DMEM培养基，消化并接种于放有细胞爬片的24孔板中。待细胞生长至60%汇合时，按LTX with PlusTMReagent转染说明，进行p EGFP-N1-CPNE3重组质粒的转染，对照组为p EGFP-N1质粒。

2.6 激光扫描共焦检测:

在2.5中细胞转染48 h后，吸除培养液，用PBS清洗两次，加入4%多聚甲醛固定10 min,0.2%Triton-100透化10 min。10%羊血清室温封闭1 h。GAPDH抗体用2%羊血清按1∶100稀释，滴加于爬片上，4℃孵育过夜。PBST漂洗爬片3次，每次5 min。罗丹明标记的荧光二抗(1∶100)室温避光孵育2 h,PBST漂洗3次。在载玻片上滴加含DAPI的封片剂，将爬片反扣在封片剂上，用中性树脂在爬片四周经行封固。选择405nm激发光检测DAPI,488 nm激发光检测EGFP和Copine-3-EGFP融合蛋白，552 nm激发光检测GAPDH。在激光扫描共焦显微镜下观察并摄片。

2.7亚细胞组分离:

在2.4中细胞转染48 h后，用PBS清洗两次，0.25%胰蛋白酶消化并离心收集细胞。使用上海碧云天生物技术有限公司的细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒，对细胞亚组份进行分离。步骤:向收集的细胞中加入200μl细胞质蛋白抽提试剂A，剧烈涡旋使细胞完全散开，冰浴15 min。加入10μl抽提试剂B，涡旋混匀5 s，冰浴1 min，再次涡旋5 s。4℃，12 000 r/min离心15 min。将上清液转移到新的EP管中，得到胞质蛋白。向沉淀中加入50μl细胞核蛋白抽提试剂，涡旋混匀30 s，冰浴30 min，期间每隔1～2 min涡旋混匀30 s。4℃，12 000 r/min离心15 min，转移上清液到新的EP管中，得到细胞核蛋白。Bradford法测定蛋白浓度，用于后续Western blotting检测。

2.8 Western blotting检测:

分别取40μg胞质蛋白和细胞核蛋白经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，100 V恒压湿转1 h至0.2μm PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h,PBST(含0.5%吐温20的PBS溶液)洗膜3次。加入Copine-3抗体(1∶1000),4℃孵育过夜，PBST洗膜3次，每次8 min。加入HRP标记的羊抗兔Ig G二抗(1∶3000)，室温孵育1.5 h,PBST洗膜3次，每次8 min。向PVDF膜上均匀滴加ECL发光液，于暗房内显影。

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