Copine-3-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白在细胞中的表达和定位（二）

2.9 免疫组织化学检测:

组织芯片经脱蜡水化、灭活内源性过氧化氢酶、热抗原修复和BSA封闭后，Copine-3抗体1∶500稀释后滴加于芯片，4℃孵育过夜。按GTVisionⅢ型免疫组织化学检测试剂盒说明操作，滴加HRP标记的聚合物(抗兔/鼠)室温孵育40 min,DAB显色2 min，苏木素复染5 min，自来水冲洗10 min返蓝，盐酸乙醇分化10 s，脱水透明后封片光学显微镜下检查。

结果

1．细胞总RNA提取及CPNE3基因扩增

如图1所示，使用总RNA提取试剂盒提取HBE的总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，3条RNA条带较为清晰、完整，没有明显弥散、降解现象，表明提取的RNA质量较好。

使用随机引物将总RNA反转录为c DNA。以c DNA为模板，利用合成的CPNE3基因特异性引物进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，出现与预期分子量大小相同的条带(约1600 bp)。

2．重组质粒p EGFP-N1-CPNE3的构建及鉴定

重组质粒p EGFP-N1-CPNE3经XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳后，其中1条片段(约1600 bp)与目的基因大小一致，另1条片段(约5000 bp)与p EGFP-N1质粒双酶切后大小一致(图2)。

对重组质粒进行DNA测序，结果经生物大分子序列比对搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)比对，插入片段与目的基因序列一致。表明成功构建了重组质粒p EGFP-N1-CPNE3。

3．荧光倒置显微镜观察

转染细胞48 h后，于荧光倒置显微镜下观察，分别转染p EGFP-N1质粒的对照组和p EGFP-N1-CPNE3重组质粒的实验组细胞均有绿色荧光。表明质粒转染细胞成功并表达EGFP(图3)。

4．激光扫描共焦显微镜观察

p EGFP-N1质粒转染的293T和H1299细胞中，EGFP在细胞内表达分布均匀;重组质粒p EGFP-N1-CPNE3转染的细胞，在激光扫描共焦显微镜下可以观察到，绿色的Copine-3-EGFP与红色的GAPDH，以及蓝色的DAPI均有重合，表明Copine-3-EGFP融合蛋白定位于细胞质和细胞核(图4)。

5．光学显微镜观察

分别收集正常培养的293T和H1299细胞，按步骤2.7操作，在加入抽提试剂B处理前后分别取样经结晶紫染色后光学显微镜下观察。加入抽提试剂B前，细胞结构完整，可观察到完整的细胞;加入抽提试剂B后，细胞膜在低渗透压条件下膨胀破裂，完整的细胞核被分离出来(图5)。表明该方法适用于胞质蛋白和胞核蛋白的分离。

6. Western blotting检测Copine-3蛋白表达

分别提取转染p EGFP-N1-CPNE3重组质粒的293T和H1299细胞的胞质蛋白和细胞核胞核蛋白，进行Western blotting检测。骨架蛋白β-actin和组蛋白Histon H1分别在胞质蛋白和胞核蛋白中被检测到;在胞质蛋白和胞核蛋白中均检测到Copine-3蛋白。表明Copine-3蛋白在细胞质和细胞核中均有表达(图6)。

7．免疫组织化学观察

对肺腺癌组织临床样品进行免疫组织化学检测，结果如图7，箭头所示，细胞质和细胞核中均有棕色显色，Copine-3蛋白定位于细胞质和细胞核。

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