肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体和gDNA标准物质的研制 （一）

目的：为满足肠道集聚性大肠埃希氏菌准确检测的实验室质量控制和能力验证需求，研制具有我国自主知识产权且具有全基因组测序信息的均匀稳定的肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA标准物质。方法：利用二代高通量测序技术对肠道集聚性大肠埃希氏菌（CMCC44841）进行全基因组测序，明确CMCC44841的种属、血清分型、多位点序列分型和毒力基因。对CMCC44841进行astA、aggR、pic特征性基因PCR确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103CFU/样品的菌球和含量为20ng/样品的gDNA小球。参照CNAS-GL017对20个菌球样品进行均匀性检验，采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于-20℃、4℃、25℃和37℃条件下保藏，对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织3家实验室进行协同标定和验证。使用5种不同基质的即食食品样本，按照国标法检验标准物质的适用性。结果：利用生物信息学分析，CMCC44841基因组大小为5.057285Mb，GC含量为50.6%，编码区基因5173个。种属鉴定结果为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli），血清预测结果为O127:H21，MLST为ST40型，携带除aggR、astA、pic之外其他相关的毒力基因。PCR扩增出astA、aggR、pic片段大小分别为102bp、400bp和1111bp。菌体标准物质均匀性检验结果F=1.59，符合标准物质的要求。菌体和gDNA标准物质样品于-20℃和4℃保藏60d，25℃保藏7d，37℃保藏5d后仍然稳定。经3家实验室协同标定，菌体标准物质样品含量均为103CFU/样品。20件不同基质的食品样品加入肠道集聚性大肠埃希氏菌标准物质进行检验，均可以检出。结论：本研究所制备的肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA标准物质所用菌株来源于我国国内分离菌株，且具有明确的全基因组序列信息，均匀性和稳定性均符合要求，适用性良好，能够满足食品检测实验室的质量控制和能力验证的需求。

致泻性大肠埃希氏菌所引起的腹泻是世界范围内存在的一个重要的公共卫生问题。根据毒力因子、致病机理和流行病学特征，致泻性大肠埃希氏菌可分为5类：肠道致病性大肠埃希氏菌（enteropathogenic Escherichiacoli,EPEC）、肠道产毒性大肠埃希氏菌（enterotoxigenic Escherichiacoli,ETEC）、肠道出血性大肠埃希氏菌（enterohemorrhagic Escherichiacoli,EHEC）、肠道侵袭性大肠埃希氏菌（enteroinvasive Escherichiacoli,EIEC）以及肠道集聚性大肠埃希氏菌（Enteroaggregative Escherichiacoli,EAEC）。EAEC是一类新发现的致泻性大肠埃希氏菌，已在世界各国引起散发或暴发。美国国立卫生研究院已将EAEC归为B类生物恐怖病原体。我国各省市致泻大肠埃希氏菌流行特征分析结果显示，EAEC在食源性致泻大肠埃希氏菌中最常见，为主要毒力基因型。因此食品中EAEC快速准确的检测工作对预防和控制由其引起的细菌性食物中毒事件有着非常重要的作用。

EAEC传统的鉴定方法包括分离培养、生化鉴定、血清学鉴定和16SrDNA鉴定等，这些方法实验周期较长，且存在一定的局限性。目前PCR技术由于其灵敏度高可靠性强等优点被广泛应用于EAEC的检测中。国家标准GB4789.6-2016规定对生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行集聚热稳定性毒素A基因（enteroag gregative heat-stable enter otoxin A,astA）、集聚黏附菌毛调节基因（aggregative adhesive fimbriaere gulator,aggR）、肠定植因子基因（proteininvolve dinintestinal colonization,pic）三个特征性基因的PCR鉴定，每次PCR反应需要使用EAEC标准菌株及其gDNA作为阳性对照，以保证结果的准确性。由于复杂的食品基质背景、培养基、试剂、DNA提取、人员操作等原因可直接影响检测结果的准确性，所以在检测过程中需要稳定的微生物标准物质和DNA标准物质对整个检验过程进行质量控制，从而保证检测数据的准确性和有效性。目前国内对于EAEC菌体标准物质及其基因组DNA（genomic DNA，gDNA）标准物质并未见相关的研究报道。

自21世纪初，基因测序技术取得突破性进展，基因测序获得的数据量、测序速度和费用都得到大幅度改观。在国内，单个微生物基因组测序的费用也从数万元降低至目前几百元。通过对食源性微生物基因组进行测序、组装，能够获得90%以上的细菌DNA信息，包括种属、耐药基因、毒力因子、转移元件等信息，可对多个细菌间的基因组信息进行比对分析，在细菌鉴定、耐药机制和溯源等研究中发挥重要的作用。

本研究针对目前检验领域需求，利用高通量测序技术对肠道集聚性大肠埃希氏菌CMCC44841进行全基因组测序，研制基因组信息背景清晰、稳定性良好的即用型肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体和gDNA两种标准物质，不仅能够应用于食品检测机构的质量控制和人员考核，而且可为我国食品安全检测水平进一步提高、及时发现问题提供有力的技术支撑。

1材料与方法

1.1材料与试剂

肠道集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）CMCC44841来源于中国医学细菌保藏管理中心。

胰蛋白胨大豆琼脂（tryptosesoyaagar,TSA）美国BD公司；生理盐水国药集团；细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP日本Takara；琼脂糖Oxoid。

1.2仪器与设备

FreeZone12L冷冻干燥机德国LABCONCO公司；PL2002电子天平瑞士梅特勒-托利多公司；Thermo1389生物安全柜、205050GC恒温培养箱、冷冻离心机、NanoDrop2000微量核酸蛋白测定仪、Qubit荧光定量测定仪美国Thermo公司；FORMA恒温摇床西班牙IUL公司；VITEKCompact2自动微生物分析系统法国梅里埃公司；Autoflex飞行质谱德国Bruker公司；C1000PCR仪、紫外凝胶成像系统美国伯乐公司。

相关链接：大肠埃希氏菌，毒素，聚合酶，标准物质

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