聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳在环境微生物中的应用（一）

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction), 简 称 PCR,是一种分子生物学技术，用于放大特定 的 DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制， 是一种体外扩増核酸序列从而得到多个核酸拷贝 的技术。根据扩増的模板、引物序列来源及反应条 件的不同可将PC R技术分为以下几种$(1)反转录 PCR技术，即在mRNA反转录之后进行的PC R扩増 ，可以用来分析不同生长时期的mRNA表达状 态的相关性；(2)竞 争 PCR,即一种定量PCR,通过 向 PC R反应体系中加人人工构建的带有突变的竞 争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的 浓度，对目的模板作定量研究；（3)扩増的rDNA限 制酶切分析技术，是美国最新发展起来的一项现 代生物鉴定技术，它根据原核生物rDNA序列的保 守性，将扩増的rDNA片段进行酶切，然后通过酶 切图谱来分析菌间的多样性。

变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 （ denaturing gradient gelelect rophoresis，DGGE) 技术应用于微生物生态学已经历 1 0 多年，它对各种环境中的微生物群体 研究起到了重要作用。D GGE是应用于染色体 D N A点 变 异 检 测 的 方 法 。 1 9 9 2年荷兰科学家 Gerard Muyzer在西班牙召开的第6 次微生物生态 学会议上，首次介绍了 DGGE技术在微生物生态 学研究上应用的可能性516。1993年 Muyzer等526首次 将 DGGE用于微生物研究，更加完整和准确地描 述了微生物种群多样性、数量比例和系统进化等。 它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电 泳更高，可以检测到一个核苷酸水平的差异。本文 综述了 PC9 - D GGE技术的基本原理和过程及其 在研究微生物群落多样性、微生物群落动态变化 等领域中的应用，为快速和准确地分析微生物菌 群组成、动态变化及特种菌的跟踪等提供了一个 非常有效的分子生物学技术。

1 PCR- DGGE的原理与方法

1.1 基本原理
PC9 -DGGE是利用尿素及甲酰胺2 种变性物 质制成一种由低至高浓度的变性梯度电泳胶，由 
于变性物质的作用，胶体上进行电泳的双股DNA 序列会产生部分变性，形成部分单链（ partial single strand)，随着每一个D N A样品核酸序列的不同，部 分变性解离的程度也不相同，因此其在电泳胶中 的移动速度也有所不同(双股快、单股慢)，使得部 分变性的D N A会在相同时间内，在胶体上跑出不 同的距离。而 D N A变性的程度则与其解链温度 (melting point ,Tm) 有 关 ，不同序列的D N A会有不 同的Tm，低 T m 的 DNA会在低浓度的变性物质作 用下产生变性形成部分单链，而高T m 的 DNA则 必须在高浓度的变性物质作用下才会产生变性。 因此，利 用 DGGE可以将大小相同、序列组成不同 的 D N A鉴别开来。

1.2 PCR-DGGE 流程

PC9 - DGGE的基本流程是，首先从环境中取 得样本，如地下水、活性污泥、生物膜等，进行微生 物 总 D N A的提 取 ；然后通过聚合酶连锁反应 ( PC9 ) 将提取的总D N A中的特定序列进行扩増， 其扩増产物利用DGGE进行分离；最后，对 DGGE带进行测序并鉴定分析或者被印渍在尼龙膜上与 标记的寡核苷酸专一性探针进行杂交，鉴定群落成 员。在 PC9 - DGGE分子生物技术中，样品总DNA 的提取和纯化是前提，引物设计及其PC9 方式是 关键。为了更好的显示DGGE条带，可以选择不同 的染色方式（EB、SYB9 Green I536和银染)。其 中 ， SYB9 Green I 染色的优点是背景色低，可以观察 到尽可能多的条带;银染的灵敏度最高，但银染过 后的条带不能用于杂交分析546。

1.3 总 D N A 提取

沉淀物、活性污泥和生物膜等样品中细菌种 类复杂且混杂有大量有毒物质，如何使所有细胞裂 
解、充分释放DNA、有效去除杂质，建立高效、可靠 的 D N A提取方法 成 为 研 究 者 关 注 的 热 点 。总 D N A提取首先需要对样品进行解絮凝和破碎细 胞 ，然后萃取总DNA ,最后纯化DNA。解絮凝和破 碎细胞常用的方法有Bead-beating法 、冷冻-解冻 法、酶法、化学法(表面活性剂或碱）、超声破碎、液 氮下研磨、Q IT或者它们的组合等。Bead-beating 法 ，即微生物细胞在苯酚或SD S萃取液中用玻璃 珠将细胞打碎、破壁,该法最大的缺点是含有大量 的腐殖酸，且 D N A会被剪断。酶法,即微生物细胞 分散在热SDS溶液中，然后采用溶菌酶、蛋白酶Q 和蛋白酶E 等进行处理。化学法是采用化学试剂 使微生物细胞裂解，其混合液由多种表面活性剂、 
NaCl及各种缓冲液组成。Heuer等556比较了这些不 同的细胞破碎方法的功效和重复性及对D N A萃 取效率的影响。

在解絮凝和细胞破碎之后，进 行 D N A萃取和 纯化。将复杂的细胞分子混合物加人有机溶媒，除 去蛋白质及其它成分，从而纯化DNA。利用酚及氯 仿可使蛋白质变性（denaturation) 的特性来进行萃 取的步骤,D N A和 ：R N A不溶于有机溶媒中，而溶 于水层。另外，常利用琼脂凝胶来分离不同大小的 D N A片段或用以纯化DNA。目前从活性污泥中提 取 D N A的报道很多[6^ 。Miller等586比较了不同表 面活性剂(SDS、 Chelex 1 0 0、异硫氰酸胍）、不同物 理破碎方式(微珠机械研磨、冷冻-解冻裂解）和酶 消化等对D N A的提取率和分子量大小的影响。结 
果表明，用 SD S结合氯仿或苯酚进行玻璃珠研磨可以优化D# A 提取量及分子量。在 SDS处理前进 行 溶 菌 酶 消 化 或 者 异 硫 氰 酸 胍 处 理 或 者 加 人 ChelexlOO树脂都不能提高D N A产量。在一个含 有氯仿、SDS、N aC l和磷酸-Tris (pH 为 8)缓冲液 的混合裂解液中采用玻璃珠机械研磨是最好的物理 破碎方式。低速率、短时间(3〇!l 2Os)是玻璃珠机械研磨 的最佳条件。比较了 4 种 D N A纯化方式(硅胶键合 DNA、凝胶电泳、醋酸铵沉淀和交联葡聚糖G-2OO 
凝胶过滤)#表明交联葡聚糖G-2OO柱纯化是最好 的纯化办法。L eff等比较了 Ogram法[lO]、Tsai法[ll@ 和 Jacobsen法>l2@ 3 种方法。其中，Jacobsen法提取 的 D N A产量最低，但是纯度最高；Ogram法提取 的时间最长，D N A产量最高，但是纯度一般;Tsai 法提取的时间最短，其产量中等，但是纯度最低。

萃取效率、D N A的分子量大小和纯度是DNA 萃取的关键指标。Niemi等>l3@证明了 D N A分离和 纯化过程影响样品中微生物菌群的结构。很多研 究人员米用改良方法来提高D N A的提取率和纯 度。比如，Purohit等>l4@报道了在核酸预萃取之前, 用 pH 为 9~lO 的 5Oc c o I/L-1 Tris-HCl 进行洗涤。 采 用 O.Ol Q 吐温-2O 在 5O " 下进行预处理，然后 用有机溶剂丙酮和石油醚萃取杂质可以提高DNA 纯度。此外，升温(6O°C~沸腾）、加人苯酚或氯仿或 加人螯合剂（ED TA和 Chelex 1OO) 等措施也能提 高 D N A提取效率。

1.4 P C R 扩增

P C T 扩 増 是 PCT-DGGE技术中至关重要的 步骤。通常采用 16S rD N A中的保守区作为引物进 行 P C T反应。这是由于 16S rDNA[l5-l6@具有以下几 个特点％ (l ) 16S rDNA约 为 15OO个核苷酸长，序列 长短适中,适合用作分类学上的研究；(2)任何一种 原核生物体都具有16S rDNA $ (3) 16S rDNA非常 保守;(4) 16S rDNA不会在不同的个体间进行基因 交换，各物种具自己的独特序列；(5)目前已有相当 完 备 的 16S rDNA基因资料库，经 过 GenBank和 
Tibosomal Database Project ( TDP) 基因资料库作 对比分析，并可进行亲源关系分析、鉴定等。Y u等E17研 究了 16S rDNA 不同可变区 V l 、V3 、V5 、V6 、V8 及 V l~V3 、V3~V5 、V6~V8 区的P C T 扩増产物及 其 DGGE结果。结果表明扩増V3 区及V3~V5 区的引物为最佳引物选择。V3 区的PCT-DGGE条 带数最多、分离效果最好。如果需要较长的扩増产 物 ，则选择V3~V5 区。

为了提高DGGE的检测敏感性，通常在一侧引物 的 5 &端设计増加一段富含G C的区域(GC2Clamp， GC 钳，其长度通常为3O~5O个核苷酸）[18]，避免了 DNA 的完全解链，从而提高了不同碱基的检出率；或者 对传统的P C T模式进行改良以提高D G G E的灵 敏度，巢 式 PCT(Nested PCT) 就是应用最广泛的一 种 ，它由两轮P C R扩増和利用两套引物对所组成。 首先对靶DNA进 行 第 l 步扩増，然后从第l 次反 应产物中取出少量作为反应模板进行第 2 次扩 
増 ，第 2 次 P C R 引物与第l 次反应产物的序列互 补 ，第 2 次 P C R扩増产物即为目的产物。

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