基于紫外可见分光光度法检测烟碱公式的探讨（二）

2.2 萃取溶剂对烟碱的影响

烟碱是强极性的有机物，易溶于水和甲醇，该试验选取不同浓度的盐酸、氢氧化钠、氨水和甲醇考察不同溶剂的萃取效果（表2）。

由表2可知，不同浓度的甲醇溶液中烟碱含量总体高于氢氧化钠溶液，与氨水和盐酸萃取效果无显著性差异。根据许燕娟等的研究结果，碱性溶液的强度对烟碱萃取率有较大影响，相同浓度下氨水溶液比氢氧化钠溶液检测到的生物碱种类多。类似地，Li等用不同浓度氨水萃取烟叶中的生物碱，发现6%氨水好于其它浓度，也好于氢氧化钠溶液。综合考虑到甲醇溶液相比氨水和盐酸溶液有利于样品溶液的储存和液相色谱柱以及具有较好的抑菌性，因此，采用5%甲醇作为后续试验的萃取溶剂。

2.3 萃取时间对烟碱萃取率的影响

超声、微波等常用于辅助萃取试验，然而它们在提高萃取率的同时，也会带来更多杂质，这对于采用紫外分光光度法检测非常不利，因此，选择较为温和的常温震荡法进行萃取。由表3中可以看出，随着萃取时间的延长，萃取率升高，而在25、30 min时无显著差异，为保险起见采用30 min作为萃取时间。

2.4 烟碱含量测定公式的探讨与拟合

原公式以236和282 nm为梯形的中位线法推测杂质在259 nm处的干扰。由图1可以看出，由于杂质的干扰，萃取液的紫外吸收谷底由烟碱的236 nm红移至240～242 nm处，而与之等距离的是276～278 nm。但从图1中可以看出，在波长小于278 nm时，4种类型样品溶液的紫外吸光度与波长形成的斜率较大，为减小误差而检测279～282 nm处吸光度。因此，以240、259和282 nm的吸光度用于新公式的拟合。烟碱含量以HPLC法检测结果为基准。

从表4中吸光度与烟碱含量的相关性结果可以看出，烟碱含量与240 nm相关性接近显著水平，这是因为烟碱在240 nm有紫外吸收，但又有杂质干扰造成的；与259 nm处吸光度相关性达到显著水平，这正是采用该方法原理所在。烟碱与282 nm处的吸光度相关性较差，这是因为烟碱在该处无吸收（图1），其吸光度是因为杂质的干扰。而样品溶液在240、259和282 nm处的吸光度之间呈极显著相关性，这恰好说明杂质对这3个波长处的吸光度影响一致，这正是原公式建立的基础。

以20个烤烟样品在240、259和282 nm处的吸光度为自变量，以HPLC检测烟碱含量为因变量用SPSS软件拟合回归得到拟合方程为：

C=（0.080 7+0.426 9×A259 + 0.473 9×A240 -0.631 2×A282）V/m

式中，C为烟碱含量/%，A259，A240和A282分别为样品溶液的吸光度，V为样品溶液体积/L，m为烟样质量/g。

再分别以2个公式对剩余57个烟叶样品烟碱含量进行计算，然后分别将计算结果除以HPLC检测结果，则比值越接近1说明检测越准确。由图3可以看出，全部样品的原公式计算结果与HPLC检测结果的比值基本呈正态分布，且在0.75～1.25的部分占49.12%；而烤烟样品的比值在0.75～1.25的占55.88%，集中度略有提升；对于晾晒烟样品，其比值也呈正态分布，但集中度较烤烟低，0.75～1.25的仅占39.13%。全部样品的拟合公式计算结果与HPLC检测结果的比值基本呈正态分布，0.75～1.25的占61.40%，高于原公式；烤烟样品的比值在0.75～1.25的占76.47%，集中度有大幅提升；对于晾晒烟样品其集中度较低，比值在0.75～1.25也是仅占39.13%，但是比值在0.5～0.75和1.25～1.60的分别由17.39%、21.74%提升至26.09%、30.43%。可以看出，2个公式的结果均是烤烟集中度高于晾晒烟，这是因为：1） 2种方法的建立基础为烤烟，2） 晾晒烟的杂质对吸光度的干扰有差别。

3 讨论与结论

4种类型烟叶样品的紫外扫描显示，3种晾晒烟的图形一致而与烤烟有差别，表现为峰谷比值前三者较为接近，以及吸收波长大于276 nm后的走势呈缓慢下降而烤烟的紫外吸收几乎不变，说明不同烟草类型的杂质对吸收的影响有所差异。通过对不同萃取溶剂的考察发现，甲醇、盐酸和氨水萃取效率较高，选择甲醇作为萃取溶剂，是因为较好的抑菌性，并且有利于样品溶液的保存以及对色谱柱友好。

原公式建立的基础是朗伯比尔定律即烟碱含量与吸光度成正比。但是在实际测定过程中，由于检测仪器等的误差，标准曲线或者拟合曲线一般呈线性关系而非正比关系。另外，该试验紫外扫描图和文献中均显示烟碱在236 nm处有一定的紫外吸收，而不是无吸收，所以不能将236 nm处的吸光度全部作为杂质。样品溶液在240、259和282 nm处的吸光度之间存在极显著相关性说明杂质对这3处的吸光度影响较为一致，这正是2个公式建立的基础。通过2个公式的计算结果与HPLC结果的比值分布可以发现，对于烤烟样品，新拟合公式的精确度较原公式有大幅提升；而对于晾晒烟样品则没有明显提升，这是因为2个公式的建立均是以烤烟为基础而建立的，然而晾晒烟的杂质与烤烟不一样，这在紫外扫描图中也有所反映。下一步将收集更多晾晒烟样品，以建立更适用于它们的计算公式。

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