农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法（一）

一、免疫分析基础

免疫分析(immunoassay，LA)是一种以抗原抗体特异性识别与可逆结合反应为基础的对目标分析物进行定性分析和定量分析的技术。

与常规理化分析相比，免疫分析具有选择性好、灵敏度高、分析容量大、简便快捷、成本低、安全可靠等优点，可大大简化甚至省去样品前处理过程，可检测极性强、难挥发、具有同分异构体的农药，不需要贵重仪器，对使用人员的专业技术要求不高，容易普及和推广。基于免疫化学技术开发的免疫检测试剂盒和检测卡，可应用于大量现场样品的快速检测。

20世纪90年代以来，农药、兽药等小分子化合物免疫分析技术的研究和开发进展迅速，在粮食、水果、蔬菜、茶叶、蜂蜜、肉、蛋、奶等农副产品和水、土壤等环境样品中农药、兽药残留物快速监控方面发挥了重要作用。世界粮食与农业组织(FAO)向许多国家推荐免疫分析技术，美国化学会将免疫分析、色谱分析(包括气相色谱和高效液相色谱)共同列为农药残留分析的主要技术，免疫检测结果也被列入具有法律效力的证据，成为20世纪后期以来研究开发和应用的热点之一。

(一)抗原

抗原(antigen，Ag)是一类能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产物(抗体或效应细胞)发生特异性结合的物质。抗原性强的物质多数是结构较复杂、分子质量大、具有异物性(抗原与所刺激的机体自身物质的差异性)的物质。病原微生物、组织、细胞、异源蛋白质等多具备上述性质，所以都是良好的抗原。抗原具有免疫原性和反应原性两种性质。免疫原性是指抗原刺激机体后，诱导免疫系统发生免疫应答，产生相应抗体或效应细胞的特异性免疫反应性。反应原性是指抗原与免疫应答产物抗体发生特异性结合的免疫反应性。

1、抗原的类型抗原根据所起的作用分为完全抗原和半抗原，根据来源和制备方法又可分为天然抗原和人工抗原，根据其与机体的亲缘关系可分为同种异体抗原和自身抗原等。

(1)完全抗：原完全抗原(COF~@ete antigen)简称抗原，是一类既有免疫原性，又有反应原性的物质。大多数蛋白质、细胞、病毒、细菌等都是完全抗原。

(2)半抗原：半抗原(hapten)是指具有反应原性，但无免疫原性的物质，又称为不完全抗原。半抗原分为复杂半抗原和简单半抗原。复杂半抗原(如大多数结构相对复杂的有机化合物等)不具有免疫原性，但具有反应原性。简单半抗原(如链烷等)既不具有免疫原性，又不具有反应原性。

(3)天然抗原：天然抗原是指来自天然生物(如动物、植物、微生物等)的抗原，这类抗原包括细胞、组织、蛋白质、核酸、杂多糖、细菌、病毒等。天然抗原一般都是良好的完全抗原。

(4)人工抗原：人工抗原包括经过人工化学修饰或改造的天然抗原、全合成人工抗原和以大分子为载体的人工抗原。为了研究免疫原性的化学基础，可用已知化学基团置换复杂天然抗原表面的特定基团得到人工化学修饰或改造的天然抗原，如2，4-二硝基苯(DNP)修饰蛋白、碘化蛋白等。全合成抗原多为高分子聚合物，如由氨基酸聚合成的多肽等。相对分子质量小于2 500的小分子一般不具备免疫原性，但可将小分子化合物与适当大分子的载体(如蛋白质)共价耦联制备人工抗原，免疫动物获得对相应小分子化合物具有特异性识别能力的抗体。

(5)同种异体抗原：同种异体抗原(alloantigen)是指存在于人、同种动物不同个体(同卵孪生者除外)的抗原性物质。当某个体的细胞或组织进入另一个体时，可引起免疫应答。人类血液中的红细胞血型抗原和白细胞抗原均属此类。

(6)自身抗原：自身抗原(autoantigen)是指引起自身免疫应答的自身组织成分。一般自身组织对机体没有免疫原性，但在外伤、感染、电离辐射、药物等影响下，自身组织可以发生变性成为自身抗原，刺激机体产生免疫反应。自身抗原分为隐蔽的自身抗原和修饰的自身抗原。

2、影响免疫原性的因素

(1)异物性：抗原的化学组成和结构差异越大、生物的种属和亲缘关系越远，则免疫原性越强。如鸡卵清蛋白对家禽是弱免疫原，而对羊、兔等动物则是强免疫原。

(2)分子大小：抗原分子质量越大其免疫原性越强。相对分子质量大于10⁵的蛋白质是较强的免疫原，相对分子质量小于10⁵的物质通常是弱免疫原。Young和Atassi(1986)的实验结果表明，免疫原性要求的最小多肽分子是由6个以上DNP赖氨酸组成的寡聚肽。在天然多肽中，目前已知能够引起免疫应答的最小分子是相对分子质量为3 480的升血糖素。

(3)化学组成与结构：除分子质量外，抗原的免疫原性还取决于其化学组成和结构(包括化学基团和构象)。结构越复杂的抗原，其免疫原性越强。比如杂多糖具有免疫原性，而纤维素、糖原、长链烷烃等虽然分子质量大，但化学结构比较简单，则不具备免疫原性。有些抗原对酶、光、热、氧、化学试剂等因子敏感，化学组成和结构(包括立体结构)易发生变化，其免疫原性也容易发生改变，蛋白质变性后免疫原性会大大降低。

(4)物理状态：颗粒抗原(如病毒等)比溶解性抗原的免疫原性强，球状蛋白比线状蛋白免疫原性强。

3、农药人工抗原：农药、药物等小分子化合物一般不具有免疫原性，但许多农药、药物具有反应原性。Landsteiner(1917)在小分子化合物免疫分析方面进行了开创性研究工作，他将氨基苯磺酸重氮化后与蛋白质的酪氨酸残基酚羟基邻位结合，制备人工完全抗原，用该人工抗原免疫动物，获得了抗氨基苯磺酸抗体，在此基础上建立了氨基苯磺酸的免疫分析方法。将目标分析农药以半抗原的形式与分子质量大的蛋白质共价耦联制备人工抗原，使农药分子突出于蛋白质表面作为抗原决定簇，以人工抗原免疫动物，诱导免疫系统发生免疫应答，产生抗目标分析农药的特异性抗体，在此基础上建立对该农药具特异性识别能力的免疫分析方法。

事实上，并非所有农药半抗原与载体蛋白质共价耦联后免疫动物，都能产生抗相应农药的特异性抗体。如对酶、光、热、氧、化学试剂等因子敏感的农药，在合成半抗原、制备人工抗原、免疫动物制备抗体的过程中易发生结构变化，难以获得对这些农药具特异性亲和力的抗体。抗原抗体反应一般在水相中进行，氢键和静电引力是维系抗原抗体亲和力的主要作用力之一。结构简单的链状烷烃，疏水性强，即使其分子质量大，与载体蛋白共价耦联后免疫动物，也难以获得抗链状烷烃的抗体。许多具有极性取代基、结构较复杂的农药(如取代杂环、取代芳香环类农药，甚至是含三元环的拟除虫菊酯)半抗原共价结合在蛋白质表面，成为特定的抗原决定簇，容易激活动物的免疫系统，产生对相应农药具特异性亲和力的抗体。而一些结构简单、分子质量小的农药(如甲胺磷)，虽有一些免疫化学研究报道，但至今尚未真正获得对甲胺磷具特异性亲和力、能够对甲胺磷进行高灵敏度检测的实用性抗体。

(二)抗体

抗体(antihody)是免疫系统受抗原刺激后产生的能与抗原、半抗原发生特异性结合的球蛋白。免疫球蛋白(immu：nogl()bulin，Ig)通常是一组具有抗体活性和抗体样结构的蛋白质。免疫球蛋白普遍存在于脊椎动物(包括人)的血液、组织和外分泌液中。所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗体，如骨髓瘤蛋白的结构与抗体相似但无免疫学活性，具有免疫活性的免疫球蛋白才能称为抗体。

参考资料：农药残留分析，如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系。

相关链接：试剂盒，微生物，白细胞，氨基苯磺酸