超临界C02法优化番茄红素脂质体的配方工艺（一）

发布时间：2021-04-09 13:06 编辑者：周世红

番茄红素广泛存在于自然界的成熟红色果实当中，其中番茄、西瓜、石榴中含量较高。在人体的某些器官，例如：血液、消化道和肝脏中也存在番茄红素。番茄红素的分子式为C40H56，含较多的双键，呈开链式结构，因此具有很强的抗氧化性。可通过一系列的生理生化反应，起到预防心血管疾病、控制动脉硬化、提高免疫功能和延缓衰老等多种重要的生理功能。

由于番茄红素是脂溶性植物色素，而且不饱和开链式结构使其具有较差的稳定性，易氧化水解，发生异构化。这在很大程度上限制了番茄红素的应用与开发。脂质体具有两亲性，将番茄红素包埋在其中，可有效的提高番茄红素的应用价值，较大程度上发挥其生物活性。提高番茄红素的消化稳定性。

目前制备脂质体的方法主要有乙醇注入法、高压均质法、薄膜超声法等。这些方法由于引进了较多的有机溶剂，且操作过程繁杂。导致所制备的脂质体结构不稳定。超临界C0₂法与这些方法相比，具有绿色环保，操作条件温和，操作过程简单易行，所制备出的脂质体无毒无害且结构稳定的优点。脂质体的配方组成会影响脂质体的结构，进而影响所载药物的稳定性及在人体内的生物利用率。因此本实验通过优化番茄红素脂质体的配方组成以期提高脂质体的稳定性，提高番茄红素在人体中的生物利用率。为番茄红素的开发利用提供参考依据。

一、仪器与材料

1、实验仪器

MV-10ASFE超临界流体萃取系统(上海waters公司)，Alpha2—4LDplus冷冻干燥机，UV-5200紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)，KQ-250DE型数控超声波清洗装置(昆山市超声仪器有限公司)，TGl6-WS台式离心机，电子分析天平(上海越平科学仪器有限公司)。

2、实验材料

C0₂，纯度≥99.5％(哈尔滨卿华工业气体有限公司)，番茄红素标准品，含量≥98％(瑞楚生物科技有限公司)，番茄红素(LY)粗提物(市售)，大豆卵磷脂(PC)(天津市光复精细化工研究所)，胆固醇(CH)≥99％(BeijingBiotoppedScience＆TechnologyCo.Ltd)，磷酸二氢钠(天津博迪化工股份有限公司)，磷酸氢二钠(天津市天力化学试剂有限公司)，无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)，丙酮，正己烷(天津市富宇精细化工有限公司)，色谱级正己烷(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

二、方法与结果

1、实验方法

（1）番茄红素标准曲线的绘制

精密称取番茄红素标准品20mg，向其中加入正己烷：乙醇(V:V)为2:1的有机溶剂充分溶解并定容至200mL，制得番茄红素标准储备液。分别精密移取适量储备液取至10mL容量瓶中，制成浓度为10、15、20、25、30μg／mL的系列标准溶液，在474nm处，以番茄红素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，平行测定3次，绘制标准曲线，结果如图1所示。得到回归方程为：Y=16.24x+0.027，R²=0.994(X为番茄红素浓度，Y为溶液在474nm处的吸光度)。表明此浓度范围内，浓度与吸光度有较好的线性关系。

（2）超临界CO₂法制备番茄红素脂质体

称取适量番茄红素粗提物、卵磷脂、胆固醇并加入无水乙醇，超声10min，得到黄色悬浊液。将悬浊液加入萃取釜中，将磷酸盐缓冲溶解加入收集瓶中。设定各参数进行制备，待反应结束后，即可在收集瓶中得到番茄红素脂质体悬浊液。

（3）包封率测定

向制备好的番茄红素脂质体悬浊液中将入3mL丙酮：正己烷(V:V)=2:1的有机溶剂，3000r／min离心5min，离心2次，收集上清液进行吸光度测定，以空白脂质体为对照，在474nm处测定吸光度。带入标准方程中，计算游离的番茄红素含量W游。按照下述公式计算包封率：

式中：W_总为总的番茄红素的质量(g)；

W_游为游离的番茄红素的质量(g)。

（4）单因素试验

当超临界温度45℃，压强140Pa，时间30min，夹带剂流速6mL／min时，以脂质体包封率为响应值，考察胆固醇与卵磷脂质量比(g:g)3:20、1:4、7:20、9:20、11:20，磷酸盐缓冲溶液pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，番茄红素与卵磷脂质量比(g:g)1:100、1:50、3:100、1:25、1:20对番茄红素脂质体包封率的影响。

（5）响应面法试验设计

根据单因素试验结果和Box-Benhnken试验设计原理，选择对番茄红素脂质体影响显著的配方组成因素进行响应面试验设计，如表1所示。