甲醇水中咖啡因溶液标准物质的研制及不确定度评定（一）

研制了液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)校准用甲醇水中咖啡因溶液标准物质并进行不确定度评定。以咖啡因纯品、色谱级甲醇和实验室一级用水为原材料，利用质量平衡法对咖啡因纯品进行纯度核验，利用基准方法重量—容量法配制浓度9.94mg/L甲醇水中咖啡因溶液标准物质。采用液相色谱法对9.94mg/L甲醇水中咖啡因标准溶液和国家二级标准物质GBW(E)130453进行量值比对，并对溶液标准物质的均匀性、短期稳定性和长期稳定性进行考察。结果表明研制的9.94mg/L的甲醇水中咖啡因溶液标准物质的均匀性和稳定性良好，相对扩展不确定度为2%(k=2)，有效期为12个月。

0引言

咖啡因是一种中枢神经兴奋剂，同时也是国家管控的精神类药品。人们偏爱含咖啡因成分的饮料，但是，大剂量或者长期饮用会对人体造成一定损害，基于它的成瘾性和依赖性，一旦停用会出现紧张、烦躁、焦虑、心悸等症状。因此，咖啡因的检测需要快速、准确、重现性较好的方法，以保证检测量值的准确性。

标准物质具有特性量值的准确性、均匀性、稳定性等特点。标准物质是溯源链的主要组成单元，也是化学计量的重要组成部分以及量值传递与溯源的重要手段之一。标准物质被广泛应用在工业生产、商业贸易、环境保护、医疗卫生等领域。通过使用标准物质来保存、复现和传递量值，进而建立溯源性，以保证测量结果的一致性、可比性。

液相色谱质谱联用仪（LC-MS）广泛应用于石油化工、农药、食品和商品检验等领域。为了使分析结果能够统一和溯源，液相色谱-质谱联用仪应按照国家校准规范JJF1317-2011《液相色谱质谱联用仪校准规范》进行校准且仪器的各项性能指标符合用户的要求后方可使用。

本研究主要论述了甲醇水溶液中咖啡因溶液标准物质的研究工作，详细地介绍了标准物质原材料的纯度核验方法、标准物质的制备方法及定值测量、均匀性检验和稳定性考察结果。从纯品原料核验、溶液配制、均匀性和稳定性等环节对不确定度进行分析，合成标准物质的定值的不确定度。对所得到的实验结果进行分析，结果表明研制的标准物质性能良好，可望作为量值传递的标准，用于液相色谱-质谱联用仪的校准、分析方法评价以及质量控制等。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

高效液相色谱仪:UltiMate3000，具有紫外-可见光检测器(VWD)、荧光检测器(FLD)、二极管阵列检测器（DAD,Thermo公司）；卡尔费休水分分析仪：852,Metrohm公司；电子天平：XPE205DR/220g，瑞士梅特勒-托利多公司；电感耦合等离子质谱仪：NexIONTM350X,PerkinElmer公司；容量瓶：100mL,1000mL,A级，经检定合格后使用；咖啡因的纯度99.8%（标准物质RM,U=0.2%,k=2）；甲醇:HPLC级，德国默克公司；超纯水：实验室制备的符合GB/T6682-2008规定中一级实验用水，MiLLipore公司。

1.2甲醇水中咖啡因溶液标准物质的制备

1.2.1咖啡因标准物质的预处理

在溶液配制前，将咖啡因标准物质置于P2O5干燥器中干燥48小时，除去水分。

1.2.2咖啡因纯度核验

采用质量平衡法对咖啡因纯品进行纯度核验。主要成分含量采用高效液相色谱仪（峰面积归一化法）计算咖啡因的纯度。由于原材料咖啡因纯品中含有少量水分和无机杂质，无法用液相色谱法进行分析。因此采用卡尔费休水分分析仪（库伦法）对咖啡因纯品中水分含量进行测定，无机元素含量则采用电感耦合等离子质谱仪进行测定。其主要定值原理如式(1)所示。

式中，P表示主成分纯度，%；Pw表示水分含量，%；Pin表示无机元素含量，%；Ph表示液相色谱法峰面积归一化测得的主成分含量，%。Pv表示挥发性有机物含量，%；

a.液相色谱仪测定主成分含量

首先对液相色谱分析方法进行优化。在液相色谱仪中，流动相和色谱柱是影响样品分离效果的主要因素。GB5009.139-2014《食品安全国家标准食品中咖啡因的测定》是检测食品中咖啡因现行有效的方法，本实验参考该方法选用C18色谱柱，等度的方式，以流动相条件：甲醇-纯水（24∶76,V/V）为基础，进行优化。经过实验分析，在1.0mL/min等度条件下，无法实现咖啡因主峰与干扰主要杂质峰完全分离（如图1）。因此采用以1.0mL/min的甲醇-纯水（V/V）不同配比梯度洗脱优化，最终选择表1的梯度条件，在此条件下，咖啡因与主要杂质峰完全分开，峰形对称（如图2）。

采用液相色谱法峰面积归一化法的测定数据见表2。

b.咖啡因纯品杂质分析

采用卡尔费休水分分析仪（库伦法）测定咖啡因纯品中的水分含量和采用ICP-MS对咖啡因纯品中的70种无机元素含量进行分析。结果显示，咖啡因纯品原料中水分和70种无机元素杂质总含量分别为0.078%和0.001%。采用顶空-气相色谱仪（FID）未检出咖啡因纯度标准物质的挥发性溶剂残留，以0%计。

c.咖啡因纯度值的确定

咖啡因主成分Ph为99.88%，水分含量Pw为0.078%，无机元素组分Pin为0.001%，挥发性溶剂残留Pv为0%，代入质量平衡法公式（1）中计算咖啡因纯度为99.8%。

d.纯品标准物质不确定度评定

根据JJF1006-1994一级标准物质技术规范的规定，建立测量模型，分析不确定度来源，计算得到各个不确定度分量，将不确定度分量合成后得到相对标准不确定度，主要有均匀性、稳定性和定值方法引入的不确定度。经计算得到，质量平衡法定值扩展不确定度为Urel=0.2%,k=2。

1.3溶液标准物质制备

采用重量-容量法制备咖啡因溶液标准物质。在实验室恒温（20±3）℃条件下，精确称9.962mg咖啡因标准物质(纯度为99.8%)于洁净的玻璃瓶中，用少量溶剂溶解后，转入1000mL容量瓶中，再用甲醇水（80∶20,V/V）少量多次冲洗玻璃瓶，将每次的溶液转入容量瓶中，最后用甲醇水（80∶20,V/V）定容至刻度，制备的甲醇水中咖啡因溶液标准物质浓度为9.94mg/L，充分摇匀静置，随后分装于2mL安瓿瓶中，每瓶1mL，低温保存。

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