微生物计量技术研究进展及发展趋势（一）

综述了微生物测量的需求和国内外微生物计量研究的发展现状。重点介绍了微生物精准测量技术研究和微生物标准物质的研究进展，结合实际案例详细介绍了微生物计量在食品安全、生物制药、生物安全防护性能评价等领域发挥的重要技术支撑保障作用，并展望了微生物计量技术未来的发展趋势，旨在为后续微生物计量研究提供一定的参考与借鉴。

0引言

地球上生活着形形色色的生命，它们共同造就了这个多姿而美丽的世界。其中，有一大类微小的“地球居民”被称为微生物，国家科学技术名词审定委员会将其定义为：个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。大约70个微生物“肩并肩”排成一行，相当于一根头发丝的宽度。微生物虽然个头很小但是分布非常广泛，无论是繁华的现代城市、偏僻的乡村田野、还是人迹罕至的高山之巅和神秘莫测的深海之底，到处都有它们的踪迹。然而，正是这些渺小之极、默默无闻的微生物在地球上做着惊天动地的宏大事业，深远地影响着我们人类的生产生活和周围环境。

自古以来，人类在日常生活和生产实践中，已经觉察到微生物的生命活动及其所发生的作用。早在公元前二千多年的夏禹时期，就有仪狄酿酒的记载，说明当时人们已经开始利用微生物发酵来酿造美酒。在预防医学方面，我国自古就有将水煮沸后饮用的习惯。明朝李时珍在《本草纲目》中指出，将病人的衣服蒸过后再穿就不会传染上疾病，这说明人们已经意识到对微生物消毒可以有效预防传染病。古人在不自觉中利用微生物或者对微生物进行消毒的例子还有很多，但始终没有从科学层面进行解释。

17世纪80年代，荷兰科学家列文虎克用他自制的显微镜在雨水和池塘水等里面发现了许多可以活动的“活的小动物”，这是人类首次观察到微生物。然而，直到19世纪80年代，德国微生物学家罗伯特科赫发明了微生物平板分离纯化技术，并经演变成现如今微生物检测最为常用的平板培养计数方法，微生物才真正步入了定量时代。在平板培养计数方法问世以来的100多年中，它一直被称为“金标准”方法，并被广泛地应用于食品安全、临床诊断、生物制药和环境检测等领域，已经与人类的生产生活密不可分。然而，随着科学技术的不断发展，人们逐渐意识到平板培养计数法的诸多局限性，如检测时间较长、不确定度较大、微生物量值无法复测以及该方法仅仅能够培养和检测自然界中的一小部分微生物等。因此，结合计量学进行微生物的精准和快速测量成为计量研究人员紧迫而艰巨的任务。

1微生物计量关键技术研究

微生物计量是关于微生物测量及其应用的学科，是基于微生物特性研究其计量单位统一和量值准确可靠的计量学分支。发展微生物计量需要研究建立微生物测量技术和标准物质，实现微生物的特性量值与标称特性在国家和国际范围内的准确一致，保证测量结果最终可溯源到国际SI单位或国际公认单位。因此，微生物计量研究需要解决三个方面的关键技术问题：活性表征、精准测量和快速测量（简称为“活”、“准”和“快”）。在“活”方面主要研究如何表征和保持微生物的生命活性；在“准”方面是研究降低测量不确定度；在“快”方面是研究如何缩短微生物检测时间。通过以上三方面的研究来支撑微生物测量结果可比性、时效性和溯源性。

早在2011年，国际计量局（BIPM）物质的量咨询委员会（CCQM）正式成立了微生物指导专家组（MBSG），当时成员有22人，由美国国家标准与技术研究院（NIST）的Robert Kaarls任第一届主席。2012年在MBSG下设置了微生物定量和微生物定性两个工作组。2015年国际计量局物质的量委员会将原先的生物分析工作组（BAWG）分成了细胞分析工作组（CAWG）、核酸分析工作组（NAWG）和蛋白质分析工作组（PAWG），并将原先的MBSG合并到CAWG中。2016年又在CAWG内部成立了真核细胞计数、原核细胞计数、血液中血细胞计数3个焦点组（Focus Group）。原核细胞计数焦点组主要以微生物为对象合作研究具有溯源性的微生物测量方法和组织国际计量比对，旨在全球范围内构建微生物测量体系，保证微生物测量结果在国际间的等效一致，实现各国微生物测量结果的国际认可。从2012年开始至今，MBSG和CAWG先后完成和正在进行的国际微生物计量比对有3项，此外，亚太计量规划组织（APMP）和亚洲标准物质联合研发组织（ACRM）也各有1项微生物计量比对正在进行中，包括了微生物平板计数法比对、微生物流式分析法比对和微生物定性鉴定比对（见表1）。国际上目前从事微生物计量研究的机构主要有美国国家标准与技术研究院（NIST）、德国联邦物理技术研究院（PTB）、欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院（JRC-IRMM）和英国国家生物制品检定所（NIBSC）等。由此可见，发达国家和国际区域组织均高度重视微生物计量研究工作，我国也紧跟世界微生物计量发展的脚步，并结合国内产业对微生物测量的需求开展了微生物计量关键技术研究，并开始主导微生物国际计量比对，如表1所示。

1.1微生物精准测量技术研究

微生物精准测量技术的研究目标是将经典微生物培养计数方法的培养方式转变为菌体标记的非培养方式，将菌落计数和代谢物检测转变为数字信号测量方式，将人工判读计算方式转变为软件自动分析方式，从而大大提升测量精度和节省时间。美国NIST采用库尔特计数法对工程酵母菌标准物质进行定量测量，德国PTB将流式分析法用于微生物耐药性研究中微生物测量；中国计量科学研究院采用流式分析法进行细菌活菌定量测量。

流式分析技术（Flow cytometry）是对生物粒子进行多参数快速定量分析技术，由于微生物比细胞要小将近十倍，所以该技术最早只用于真核细胞检测。经过科研人员不断的对原有技术进行改进，目前流式分析技术可以实现微米级甚至纳米级微生物测量。因此，流式分析技术以其高通量、多重标记和高精准度等优势成为了微生物精准测量的潜在方法。采用荧光标记抗体特异性识别目标微生物，同时采用膜选择通透性荧光探针（例如：碘化丙啶）表征微生物活性，其原理是碘化丙啶只可以在微生物死亡破裂后进入内部对其核酸进行标记，而当微生物细胞壁结构完整时碘化丙啶无法进入胞内标记核酸，这样就可以有效区分死活菌。将荧光标记后的微生物加入流式分析仪中，微生物随着仪器的液流系统游进去，然后液流系统使微生物一个一个排成长队依次进入检测区，经过激光光源时，微生物就会被激发出特有的荧光而被探测器及时监测到，将数据传输到计算机分析系统对微生物精确计数（如图1所示）。由此可见，融合荧光标记和流式分析技术的微生物测量方法，可实现微生物活菌含量的高特异、多参数测量。

目前，中国计量科学研究院已经通过流式分析技术建立了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等多种微生物精准计量方法，该方法主要有以下几个优势：1）精确度高，测量不确定度可从原先大于15%降低到小于5%;2）特异性好，鉴定目标微生物的同时可以有效区分死活菌；3）速度快、实验操作步骤简单，测量时间可以从几天缩短到数小时，最短可达到30分钟以内。

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