农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法（七）

5、胶体金标记免疫分析：胶体金标记免疫分析(colloidal gold immurtoassay，CGIA)通常采用紫红色的纳米金颗粒来标记抗体，当金标抗体聚集到一定密度时，出现肉眼可以观察的紫红色，从而可对抗原抗体反应结果进行定性测定或半定量测定。药物、激素等小分子化合物的胶体金标记免疫分析通常采用竞争方式，实际测定方法有斑点渗漏法和免疫色谱法。

(1)斑点渗漏法：在一个塑料小盒内填充吸水性较强的垫料，紧贴垫料中部粘贴一片硝酸纤维(nitrocellulose，NC)膜，在膜中心吸附包被原(CAg)，边上吸附二抗(Abz)。洗涤去除游离物，封闭硝酸纤维膜上剩余的吸附位点。将待测样品与金标抗农药抗体(金一Ab)的混合液滴在硝酸纤维膜的中心，样品中的农药与包被原竞争结合金标抗农药抗体。洗涤去除游离物。若样品中不含待测农药，则硝酸纤维膜中心呈现红色斑点(金-AbCAg)；若硝酸纤维膜中心不显色或比空白样品显色浅，表明样品中待测农药阳性。膜边缘呈现红色斑点(金-Ab-Ab₂)，表明金标抗农药抗体(金-Ab)有效，用作金标抗农药抗体的质控点。

(2)免疫色谱法：免疫色谱法以测试条作为载体，将适量金标抗农药抗体(金-Ab)吸附于测试条中下端的玻璃纤维上，将适量包被原(CAg)吸附于测试条中端的硝酸纤维膜上，测试条中上端则吸附适量二抗(Ab₂)。在测试条最下端的样品垫上滴加待测样品溶液或将样品垫浸入待测样品溶液中，随着溶液向上扩散，玻璃纤维上的金标抗农药抗体溶解，与样品中的相应农药结合并随液体继续上行。若金标抗农药抗体上的农药结合位点被样品中的相应农药完全或部分占据，金标抗农药抗体就不能或只有部分能与固定在测试条中端的包被原结合，因而不显色或显色浅，即呈阳性。若样品中不含相应农药，则上行的金标抗农药抗体与固定在测试条中端的包被原结合形成金-Ab一CAg复合物而显紫红色，即呈阴性。如金标抗农药抗体与测试条中上端的二抗结合并显色，表明金标抗农药抗体具有免疫学活性，二抗吸附点用作金标抗农药抗体的质控点，二抗不显色表明测试条失效。

金标免疫色谱结果可用肉眼观察，不需要贵重检测仪器，操作简便快速，可进行定性测定或半定量测定，金-抗体-抗原复合物颜色稳定不变，检测结果可以长期保存。

6、亲和素生物素系统酶联免疫分析：亲和素生物素系统(avidin-biotin system，ABS)中的亲和素是一种糖蛋白，相对分子质量约65 000，每个亲和素分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素分子中含活性羧基，相对分子质量小(244)，标记方法简便，生物素羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质、糖等多种类型的大小分子形成生物素标记物。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此可以利用亲和素生物素酶系统来放大酶联免疫吸附测定(ELISA)信号，灵敏度可提高8～10倍。现在常用的是亲和素生物素系统酶联免疫分析(ABS—ELISA)包括酶标记亲和素生物素(LAB)系统和桥联亲和素生物素复合物(AB*C)系统。由于亲和素生物素系统酶联免疫分析较普通酶联免疫吸附测定多用了两种试剂，增加了操作和反应步骤，在农药分析中应用的报道不多。

(七)其他免疫分析技术

1、脂质体放大免疫分析:脂质体是一种人工合成的模拟生物膜，由磷脂分散在水介质中形成密闭的双分子单层或多层膜。在脂质体表面修饰抗原或抗体，当发生抗原抗体反应时，脂质体表面的抗原抗体复合物可激活补体，引起脂质体的溶解，释放出包容在脂质体内的标记物(如荧光素等)，标记物的释放量与膜表面抗原抗体复合物的形成量呈正比，据此建立了脂质体免疫分析法(1iposome immunoassay，UA)。脂质体膜内可包容上万个标记物分子，具有很高的信号放大作用，因而成为提高免疫分析灵敏度的有效途径之一。

2、控温相分离免疫分析：控温相分离免疫分析是将抗原或抗体固定在智能型水凝胶上，使其在水中快速反应。反应结束后，改变水凝胶的低临界相变温度(1owr critical solutiontemperature，LCST)，使复合物随凝胶沉淀而析出，从而达到与游离物分离并浓缩抗原抗体复合物的目的，然后再进行检测，可显著提高检测灵敏度。

3、毛细管电泳免疫分析：毛细管电泳免疫分析(capillary electrophoresis immLmoassay，CEIA)是将毛细管电泳强大的分离能力和免疫分析的特异性相结合的免疫分析技术。将含目标分析抗原(或抗体)的样品提取液经毛细管电泳分离，再与相应的抗体(或抗原)反应，可对复杂抗原或抗体进行检测。毛细管电泳免疫分析样品用量少，检测灵敏度高，在临床检验中得到了广泛的应用，在农药等小分子化合物的痕量分析中具有一定的开发应用价值。

4、流动注射免疫分析：流动注射免疫分析(flow-injection immunoassay，FIIA)分为均相流动注射免疫分析和非均相流动注射免疫分析，通常采用标记物。非均相流动注射免疫分析将抗体固定在载体膜上，制成均匀一致可分段使用的抗体膜带。将膜带的一部分安装于密封的微型槽内，由流动注射仪将待测物输入槽内，与标记过的待测物标样竞争结合固定在膜上的抗体，液相中(或固相上)标记物浓度的变化程度与待测物的浓度相关，通过配套的检测系统检测。均相流动注射免疫分析是在微槽内进行的均相免疫反应，检测反应前后标记物信号的变化。流动注射仪通过计算机程序精确控制反应液的种类、流向、流速、反应时间、反应温度等，具有自动进样、自动检测、自动清洗、循环重复分析等功能，结合免疫分析的特异性，实现对大量样品的高通量连续分析。

5、免疫聚合酶链式反应技术：免疫聚合酶链式反应(PCR)技术是将免疫反应和聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，PCR)结合起来的一种免疫分析方法。将DNA分子和抗体通过一定的连接分子连接起来，DNA作为标记物结合在抗体上，然后进行免疫反应，形成抗原一抗体一DNA复合物。将该复合物纯化后，进行聚合酶链式反应，使抗原一抗体一DNA复合物大量扩增，可放大检测信号，提高检测灵敏度。

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