高效液相色谱-二极管阵列检测器同时测定糕点中糖精钠和脱氢乙酸的方法研究（一）

近年来，随着食品工业的快速发展，食品添加剂在改善食品的色香味及食品品质等方面的作用越发凸显。目前常用的食品添加剂有防腐剂、甜味剂、抗氧化剂、着色剂等。为规范食品添加剂的使用，保障消费者的食品质量安全，我国GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》对各类食品添加剂的使用范围及相应限量都做了明确规定。其中，糖精钠作为甜味剂，在糕点中不得使用，但由于其甜度高、价格低廉，常常被不法商家超范围用于糕点加工过程；脱氢乙酸作为防腐剂，在糕点中的使用限量为0.59/kg，但超限量使用脱氢乙酸的现象屡有报道。因此，监管部门必须对糕点中糖精钠、脱氢乙酸的使用量进行严格管理。

我国国家标准，GB5009.28及GB5009.121分别规定了食品中糖精钠和脱氢乙酸的检测方法，但两者不能同时检测。文献关于糖精钠的测定方法主要有液相色谱法和液质联用法；脱氢乙酸的测定方法主要有：液相色谱法、气相色谱法、液质联用法及气质法。其中液相法因操作简单、不需要衍生化、使用成本低等优点，仍是目前测定食品添加剂的首选方法。徐渊金等报道了糖精钠和脱氢乙酸同时测定的方法，方法使用紫外检测器定性定量，由于紫外检测器仅靠保留时间定性，无法避免与目标组分保留时间相近的杂质组分的干扰，对基质复杂的糕点样品而言，往往会使测量结果偏高，甚至导致假阳性结果出现；王健等报道了HPLC快速测定月饼中5种添加剂的方法，方法采用等度洗脱，脱氢乙酸的色谱峰明显拖尾。针对上述方法存在的问题，本文从色谱分离、定性、定量等方面对高效液相色谱法同时检测糕点中糖精钠和脱氢乙酸做了优化和改进。方法采用二极管阵列检测器，在获取待测物质吸光度的同时，还能进行光谱图的比较，增加定性的准确性。通过优化流动相的种类、洗脱梯度及色谱柱，实现糖精钠和脱氢乙酸的同时测定，且使脱氢乙酸的拖尾现象得到抑制，提高了方法定量的准确性。方法的建立，解决了糕点中糖精钠和脱氢乙酸难以同时测定的难题，缩短了分析时间，提高了工作效率，为食品监管工作者提供有利的技术支持。

一、材料与方法

1、材料与试剂

甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；乙酸铵(分析纯，国药集团有限公司)；氢氧化钠(分析纯，国药集团有限公司)；硫酸锌(分析纯，国药集团有限公司)；脱氢乙酸(CAS：520-45-6，标准品：纯度≥99.5％；德国Dr公司)，二水合糖精钠(CAS：82385-42-0，标准品：1.0mg/mL，纯度≥99.5％；中国计量科学研究院)。0.45μm微孔滤膜：有机系。

2、仪器与设备

高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器(e2695，美国waters公司)；分析天平(感量0.1mg，MS204，梅特勒公司)；分析天平(感量lmg，MS303，梅特勒公司)；超声波清洗器(宁波新芝有限责任公司)；离心机(3-18k，德国sigma公司)；旋涡混合器(美国IKA公司)。

3、方法与步骤

（1）标准溶液配制

准确称取脱氢乙酸标准品100mg(精确至0.1mg)于100mL容量瓶中，用10mL0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解，并用水定容至刻度。分别吸取一定体积的脱氢乙酸贮备液及糖精钠标准溶液于100mL容量瓶中，用水定容。配制成浓度依次为0.4μg/mL、1.01μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的混合标准工作液。

（2）色谱条件

色谱柱：AtlanfisT3(250mm*4.6mm，5μm，美国waters公司)；流动相A为甲醇，B为10mmol/L醋酸铵(醋酸调PH=5.5)，洗脱梯度为：0～5min，16％A，5.1min～15min，28％A，15.1min～20min，80％A，20.1min，16％A，保持10min；柱温：35℃；进样体积：10μL；检测波长：230nm。

（3）样品处理

称取样品2g(精确至0.001g)，置于25mL离心管中，加入约10mL水、0.5mL0.5mol/L氢氧化钠溶液，振摇，超声10min，取出，再分别加入lmL0.42mol/L硫酸锌溶液和1mL0.5mol/L氢氧化钠溶液，用力振摇后，用水定容至刻度，摇匀。静置分层，取上清液过0.45μm有机滤膜，滤液供高效液相色谱测定。

二、结果与讨论

1、样品前处理方法优化

糕点样品含有脂肪、蛋白、淀粉、糖类等多种成分，基质复杂，对前处理要求较高。本方法研究了不同沉淀剂对目标分析物回收率的影响。比较了氢氧化钠和硫酸锌沉淀体系及亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀体系的沉淀效果。不同加标水平的样品经两种沉淀方式处理后所得回收率的比较见表1。由表1发现，样品经氢氧化钠和硫酸锌沉淀后，两种分析物的回收率明显高于用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀的样品。实验还考察了沉淀剂的用量(0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL)对目标物回收率的影响。沉淀剂用量小，沉淀效果欠佳；用量大，易产生大量絮状沉淀，对目标物产生不同程度的吸附，使回收率降低(图1，沉淀剂的用量以硫酸锌的用量表示)。综合考虑，选择lmL0.5mol/L氢氧化钠和lmL硫酸锌溶液为样品沉淀剂。

方法还比较了样品提取时，氢氧化钠的加入对脱氢乙酸回收率的影响。发现样品加入0.5mL氢氧化钠，能明显提高脱氢乙酸的提取回收率，这是由于氢氧化钠的加入，使样品中的脱氢乙酸转化为水溶性较强的脱氢乙酸钠，从而增大了目标物的在水相提取体系中的溶解度，方法的回收率得到提高。

2、色谱条件的优化

（1）色谱柱的选择

实现糖精钠和脱氢乙酸的同时测定，选择合适的色谱柱尤为关键。实验考察了SemetryC18，XbrigdeC18及AtalatisT3C18色谱柱的分离效果。结果发现，三种色谱柱对糖精钠和脱氢乙酸都有较好的保留，但是，SemetryC18及XbrigdeC18色谱柱，糖精钠和脱氢乙酸的保留时间非常接近，仅通过改变流动相中甲醇的比例难以实现两者的基线分离，且脱氢乙酸拖尾严重，严重影响定量的准确性。采用AtalatisT3C18色谱柱，能很好解决了脱氢乙酸的拖尾问题，与普通C18色谱柱相比，峰形得到了极大地改善。

（2）流动相优化

脱氢乙酸的电离常数为4.1，通过调节pH，使脱氢乙酸以单一分子形式或完全离子形式存在，峰形对称，而糖精钠的保留不受流动相pH的影响。通过优化，选择醋酸铵流动相的pH为5.5。通过优化流动相梯度，使糖精钠和脱氢乙酸的保留时间适中，与杂质很好的分离。在优化的流动相条件下，糖精钠、脱氢乙酸混合标准溶液色谱图(5μg/mL)见图2。

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