传统虾酱中酵母菌分离鉴定及碳源利用特性（二）

2.1.2 酵母菌的碳源同化试验结果

不同碳源对酵母菌的生长状况有不同影响，本试验采用葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、柠檬酸、壳聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖9种常用微生物培养基碳源试材，对大连传统虾酱中分离纯化出的8株酵母菌进行碳源同化试验，总结最适生长碳源，以及不同碳源对不同酵母菌的影响。

将8株酵母菌分别接种于9种碳源培养基中，在培养时间相同的条件下，对不同培养基上的不同菌株进行形态学分析。根据形态学结果可以看出，从碳源角度来看，葡萄糖和蔗糖几乎适应所有酵母菌的生长，并且菌落生长很快，菌落旺盛；氨基葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油作为碳源也可以使每种酵母菌生长，然而对不同种类的酵母菌的生长促进情况不同，部分酵母菌生长速度较快且旺盛，部分酵母菌生长缓慢；壳聚糖培养基上没有任何酵母菌的生长迹象。葡萄糖、蔗糖等是最常用的碳源，然而其来源通常采用淀粉水解等方式获得。开发新的可利用碳源，如氨基葡萄糖可来源于甲壳素水解产物，甘油可来源于生物柴油加工废弃物等，有助于拓宽微生物的碳源谱，以降低原料成本。

根据表2可以得出结论，对于这8株酵母，经鉴定为胶红酵母（Rhodotorulamucilaginosa）的菌株Y1、Y6，在以葡萄糖、蔗糖、甘油、甘露醇、山梨糖醇和氨基葡萄糖为碳源的培养基中均可正常生长，其中在葡萄糖和蔗糖培养基中生长情况最为良好，而在乳糖、壳聚糖和柠檬酸培养基中不能生长；Y2酵母菌株近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis）在除乳糖和壳聚糖以外的其它碳源培养基中均能正常生长，且在葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和氨基葡萄糖培养基中生长情况最好；Y3和Y4已鉴定为同种酵母菌株龙贡毛孢子菌（Trichosporondomesticum），在除柠檬酸和壳聚糖以外的其它碳源下均能正常生长，其中在以葡萄糖、乳糖、蔗糖和氨基葡萄糖为碳源的培养基中生长情况最好；Y5、Y7和Y8已鉴定为同种酵母菌株汉斯德巴氏酵母菌（Debaryomyceshansenii），在除乳糖和壳聚糖以外的其它碳源下均能正常生长，在以葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和氨基葡萄糖为碳源的培养基中生长情况最好。由表2可见，从传统虾酱中分离出的菌株，普遍具有能够利用氨基葡萄糖的特性，这预示着这些菌株具有利用氨基葡萄糖作为碳源的潜质。从这8种菌株碳源利用的分析可见，葡萄糖和蔗糖的碳源利用谱最广，壳聚糖的碳源利用谱最窄。这些微生物的挖掘，可为之后开发虾酱发酵剂奠定菌株基础。

2.2 酵母菌DNA提取及26SrDNAPCR扩增结果

以提取的8株酵母菌基因组为模板，采用通用引物26S1和26S2扩增结果，经琼脂糖凝胶电泳分离和凝胶成像系统检测结果如图2所示，可以观察到所有泳道的600bp左右位置均出现了一条清晰条带且特异性强。将样品中的PCR片段进行回收纯化后，送测序公司进行测序。

2.2.1 虾酱中26SrDNA序列同源性分析及系统发育树的建立

测序结果利用BLAST工具，与NCBＩ数据库进行同源性对比，比对结果如表3所示。由表3结果可知，菌株Y1与胶红酵母FＪ009291.1同源性达到100%，菌株Y6与胶红酵母FＪ515247.1同源性达到99%，可鉴定Y1、Y6为胶红酵母；菌株Y2与近平滑假丝酵母EU605809.1同源性达到100%，可鉴定其为近平滑假丝酵母；菌株Y3、Y4与龙贡毛孢子菌ＪN939470.1同源性达到99%，可鉴定其为丝孢酵母（Trichosporondomesticum）；菌株Y5与汉逊德巴利酵母（Debaryomyceshansenii）ＪX649975.1同源性达到100%，菌株Y7、Y8与汉逊德巴利酵母LC219505.1同源性达到100%，可鉴定菌株Y5、Y7、Y8为汉逊德巴利酵母。

根据同源性分析结果，选择同源性较高的不同参考菌株的序列，使用本地软件Mega7.0，运用Neighbor-Ｊoining法构建系统发育树，结果如图3所示。由图3可以看出，菌株胶红酵母FＪ009291.1与胶红酵母FＪ515247.1在同一分支上，亲缘关系最近，形成第1类群；菌株丝孢酵母ＪN939470.1形成第2类群；菌株近平滑假丝酵母EU605809.1形成第3类群；菌株汉逊德巴利酵母ＪX649975.1与汉逊德巴利酵母LC219505.1在同一分支上，亲缘关系最近形成第4类群。所有分离株与相对应的参考菌株同源性都在99%和100%，证明酵母菌26SrDNA序列分析结果准确，置信度高。

3 结论

本试验中分离并鉴定的酵母菌均被报道在发酵食品中与食物的蛋白质、脂肪、碳水化合物产生互相作用，对发酵食品的风味、口感、安全和营养方面等产生了有益作用。例如，Salgado等对葡萄酒中汉逊德巴利酵母产生挥发性化合物的研究表明，该酵母可产生对应10类的挥发性化合物：萜烯、高级醇、C6醇、醛类、挥发性物酸、乙酸酯、乙酯、挥发性酚、硫化合物和烃等，这些化合物可使葡萄酒的香气更加浓醇，对改善口感起到了作用。李亚莉等采用近平滑假丝酵母接菌普洱茶，结果表明，接菌的发酵茶样中主要功能成分含量均较自然发酵茶叶中的含量高，具有传统普洱茶的品质风味，且在香气和滋味方面有自身的特点，滋味醇和、厚滑，香气纯正略带乳香，说明近平滑假丝酵母对发酵普洱茶的风味、口感等起到一定的改善作用。此外，还有研究表明，海洋胶红酵母具有抗菌、抑霉等特点，可提高发酵食品的品质，延长其食品保质期。毛俊霞研究发现，胶红酵母中富含多种氨基酸，而且天冬氨酸、谷氨酸、丙氨基酸的含量较高，粗蛋白的含量为37.8%±0.52%，且由于其自身产类胡萝卜素等特点，赋予了食品抗氧化性及新的营养特性，具有提升营养价值的作用。本研究中发现的这些酵母，推测可能在虾酱特殊气味、营养等的形成方面具有重要作用，可促进虾酱中的蛋白质分解形成氨基酸，增加其独特鲜味，赋予虾酱浓郁的口感；此外，还具有提高其营养价值的作用，可能对发酵食品保质期的延长起到促进作用。

碳源同化能力是判断微生物利用不同碳源能力的指标，是微生物进行鉴定的生理生化指标，将为鉴定微生物的辅助特征提供有益补充。本文研究发现，胶红酵母对葡萄糖和蔗糖的利用能力较好，对甘油的利用率次之，不能利用乳糖和壳聚糖。毛俊霞的研究表明，发现在重庆不同果园土壤中分离的胶红酵母对蔗糖、甘露醇和甘油的利用率比较高；李新玲等在自制酸驼乳中发现了1株胶红酵母，其碳源同化试验也表明，胶红酵母对蔗糖的利用程度较高。在虾酱中发现的胶红酵母的碳源同化能力与其他研究人员的结果类似。Rivas等在玉米芯中提取的汉逊德巴利酵母优先利用葡萄糖，其次是木糖以及阿拉伯糖等；Koganti等发现，汉逊德巴利酵母可高效利用甘油，高选择性地生产阿拉伯糖醇，产量达55%，说明甘油为汉逊德巴利酵母的优良碳源，可能还对于代谢产物的生产具有一定的选择性。本研究也发现，汉逊德巴利酵母优选葡萄糖、蔗糖及山梨糖醇，此外，该酵母对甘油的利用比较显著。丝孢酵母和近平滑假丝酵母对碳源的选择性也与文献报道一致，张玉瑧等分离获得的1株丝孢酵母对葡萄糖和蔗糖利用效果最好；Preziosi-Belloy等用近平滑假丝酵母菌发酵半纤维素糖，在葡萄糖质量浓度和甘露糖质量浓度分别为27g/L和6g/L时，可正常生长，当高于此浓度时，受到抑制，因此可以看出，葡萄糖和甘露糖为近平滑假丝酵母的碳源。碳源利用程度是评价微生物特性的指标，本试验结果将为今后筛选优良的发酵菌株及发酵生产菌株碳源的选择提供一定参考。

从传统虾酱中共分离出8株酵母菌，通过对该8株酵母菌的形态学和分子生物学鉴定，鉴定结果为2株胶红酵母（Rhodotorulamucilaginosa），1株近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis），3株汉逊德巴利酵母（Debaryomyceshansenii），2株丝孢酵母（Trichosporondomesticum）。对8株酵母菌的碳源同化试验结果表明，葡萄糖和蔗糖为酵母菌生长的最优碳源；氨基葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油虽然可以使每种酵母菌生长，但利用程度不同；乳糖和柠檬酸只能促进部分种类酵母菌生长；而壳聚糖不宜用作酵母菌生长的碳源。这些微生物的挖掘，可为今后开发虾酱发酵剂奠定菌株基础，同时，也对促进虾酱中微生物资源利用，筛选合适发酵剂，推动大连传统虾酱产业发展起到积极作用。

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