维氏气单胞菌中介导的群体感应现象及大蒜提取物的干扰作用（一）

微生物的生长繁殖和代谢是导致食品腐败变质的重要因素。细菌群体感应（QuorumSenSIng，QS）是一种依赖于细胞密度的信息交流方式，以自诱导物（AuToInducerS，AIS）为群体感应信号分子，它通过调控食品中优势腐败菌的生长代谢来调控食品腐败进程。研究表明，群体感应抑制剂可通过与AIS受体蛋白结合，降解AIS分子和阻断群体感应通路等途径有效干扰细菌群体感应的表达，降低食源性细菌的致病性或致腐性。利用群体感应抑制剂靶向调控细菌的群体感应系统来抑制食品腐败，已成为食品保鲜领域的研究热点之一。

近年来，研究学者在水果、蔬菜和中草药等天然植物的提取物中筛选到很多安全、有效的活性成分，这些物质作为群体感应抑制剂可有效降低微生物的毒性。大蒜提取物是具有群体感应抑制活性的物质，能在亚抑菌浓度下阻断N-酰基高丝氨酸内酯（AHLS）信号分子介导的群体感应系统，抑制其毒力因子产生，然而，目前关于大蒜提取物对腐败菌腐败能力的干扰作用仍少有报道。

本试验以在发酵鱼糜中筛选到的腐败菌维氏气单胞菌为对象，分析其AHLS介导的群体感应现象，探究大蒜提取物对该细菌产AHLS活性、生物膜形成能力、毒力基因表达和致腐能力的干扰作用，以期利用大蒜提取物等群体感应抑制剂作为食品保鲜剂，提高食品的安全性和货架期。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：新鲜大蒜，购于杭州市潮王路菜市场；鱼糜，A级海产铜盆鱼糜，由上虞市傣之味食品有限公司提供，贮藏于-18℃冰箱中，备用。菌种：维氏气单胞菌，分离于发酵鱼糜，添加20%甘油，保存于本实验室-80℃冰箱中。根癌农杆菌[AgrobActeriumtumefAeiensA136（PcF218/PcF372）]，壮观霉素抗性，用量为50μg/mL。

试剂：甲酸、乙酸乙酯、二甲基亚砜（DmSO）、甲苯为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、结晶紫、吖啶橙、壮观霉素、细菌基因组DnA快速抽提试剂盒、细菌总RnA快速抽提试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；RP-c18F254S反相薄层层析板，德国merck公司；AHLS标准品，美国SIgma公司。
1.2仪器与设备

SPecTramaxm5酶标仪，美国molecularDevIceS公司；LIFeEcoPcR仪，杭州博日科技有限公司；FV300激光共聚焦显微镜，日本OLYmPUS公司；STePOne型荧光定量PcR仪，美国ABI公司；PHS-3c型数显酸度计，上海精科仪器有限公司；K9840自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；e2695型高效液相色谱仪，美国WaTerS公司；YXQ-LS-SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌产AHLS分子检测

参照Ravn等的方法，采用生物报告菌法分析细菌产AHLS分子的活性和种类。

采用平行划线法分析AHLS的产生情况，在含1%琼脂的LB平板上涂布40μLX-gal（20mg/mL），将活化12h的根癌农杆菌与待测菌平行划线，于30℃中培养24h，观察根癌农杆菌的颜色变化。

将待测菌培养液离心（8000×g，5mIn，4℃），上清液用等量酸化乙酸乙酯（0.5%甲酸）提取2～3次，合并有机相，旋转蒸发仪蒸干溶剂，用DmSO重新溶解，于-20℃保存待用。

采用平板扩散法分析AHLS活性变化，100mL含1%琼脂的LB培养基中加入4～10mL活化的根癌农杆菌和500μLX-gal（20mg/mL），混合均匀后倾注平板，待冷却凝固后打孔，加入40μL待测菌AHLS提取液，于30℃中培养36～48h，观察平板的颜色变化。

采用薄层色谱法（TLc）分析细菌产生AHLS种类，取1～10μLAHLS标准品与细菌AHLS提取物样品，点样于c18反相薄层层析板。用层析液甲醇-水（体积比60/40）充分展开，取出后在常温下挥干溶剂。制备含根癌农杆菌的固体培养基，倾于板上，凝固后在30℃无菌密闭容器中培养36～48h，观察颜色变化。AHLS标准品的浓度分别为：0.1mmol/LN-丁酰基-高丝氨酸内酯（c4-HSL）、10μmol/LN-己酰基-高丝氨酸内酯（c6-HSL）、0.04μmol/LN-庚酰基-高丝氨酸内酯（c7-HSL）、0.06μmol/LN-辛酰基-高丝氨酸内酯（c8-HSL）、0.8nmol/L3-氧代-己酰基-高丝氨酸内酯（oxo-c6-HSL）和1.6nmol/L3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯（oxo-c8-HSL）。

1.3.2 细菌的生长曲线及培养液PH值的测定

将活化12h的待测菌接种到100mLLB液体培养基中，在30℃下摇床培养24h，间隔一定时间取样，参照GB/T4789.2-2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》计数，同时利用酸度计测定培养液PH值的变化。

1.3.3 基因分析

采用PcR技术分析细菌的luxRI同源基因、鸟氨酸脱羧酶基因（ODC）、赖氨酸脱羧酶基因（LDC）、鞭毛基因（flA）、弹性蛋白酶（AhyB）、丝氨酸蛋白酶基因（ser）、脂肪酶基因（liP）。将细菌过夜活化，利用细菌DnA提取试剂盒提取细菌DnA模板，使用的引物见表1。50μL反应体系，PcR扩增程序为：预变性95℃3mIn，变性95℃30S，退火55℃1mIn，延伸72℃1mIn（35个循环），终延伸72℃10mIn。其中，扩增AhyB和flA基因时退火温度为59℃。将扩增到的基因片段进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下成像，同时送往生工生物工程有限公司测序。将得到的序列进行BLAST搜索和同源性分析。

1.3.4 大蒜提取物的制备

参照RaSmuSSen等的方法制备大蒜提取物。将市售大蒜去皮，称取150g于300mL甲苯中匀浆，萃取12h后用WhaTman1号滤纸过滤。向滤液中加入150mL无菌水，在室温条件下搅拌24h，两相分离得水相，经0.22μm滤膜过滤后得1g/mL大蒜提取物。通过二倍稀释法确定大蒜提取物对待测菌的最小抑菌浓度。

1.3.5 β-半乳糖酶活性的测定

将待测菌过夜活化12h，取500μL细菌培养液接种至100mLLB液体培养基中，分别加入1mL不同质量浓度的大蒜提取物（终质量浓度为0.15～1.20mg/mL），以无菌生理盐水为对照，于30℃摇床中振荡培养12h，将培养液离心（8000×g，10mIn）得上清液。参照mIller的方法测定生物报告菌的β-半乳糖酶活性。

声明：本文所用图片、文字来源《中国食品报》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：大蒜，二甲基亚砜，壮观霉素，N-辛酰基-高丝氨酸内酯