维氏气单胞菌中介导的群体感应现象及大蒜提取物的干扰作用（二）

发布时间：2021-08-08 19:22 编辑者：特邀作者周世红

1.3.6 生物膜形成能力的测定

参照KuSada等的方法，采用结晶紫染色法分析大蒜提取物对细菌生物膜形成能力的影响。将细菌培养液按1∶1000的比例稀释，加入无菌96孔板中，加入不同浓度的大蒜提取物（终质量浓度为0.15～1.20mg/mL），30℃静置培养24h。移除培养液，用无菌去离子水冲洗3次，无菌风干燥，加入200μL0.1%结晶紫染色液，室温染色15mIn，无菌水冲洗3次，加入1mL95%乙醇漂洗生物膜，将洗液于波长570nm处测定OD值。

参照PackIavaThｙ等的方法，利用激光共聚焦显微镜（cLSm）分析细菌生物膜结构的变化。将细菌培养液按1%的比例接入含1mLLB培养基的24孔板中，加入1.20mg/mL大蒜提取物和直径为1cm的圆形盖玻片，静置培养24h。用无菌水轻轻冲洗玻片上未粘附的细胞，0.1%吖啶橙染色1mIn。洗去多余的染色液，将盖玻片置显微镜下观察。该显微镜装有激发波长为515～560nm的激发滤光器及60×（60倍）的油镜，其荧光显微镜照片与光镜照片均由FluovIewv5.0软件获得

1.3.7 基因表达量的测定

采用实时荧光定量PcR（RT-PcR）技术。细菌活化后加入1.20mg/mL大蒜提取物培养24h，利用细菌RnA提取试剂盒提取细菌RnA。在20μL反应体系中，加入10μL2×荧光定量PcR预混体系，0.4μL10μmol/L上、下游引物，2μLcDnA模板。PcR扩增程序为：预变性95℃3mIn，变性95℃7S，退火57℃10S，延伸72℃15S（45个循环）。相对表达量（RQ）由2-ΔΔcT方法计算得出。

1.3.8 细菌腐败能力的测定

参照Zhao等的方法制备无菌鱼糜肉汁。冷冻鱼糜解冻后，按质量比1∶1加水打浆，加热煮沸5mIn后静置，冷却至室温。用2层纱布过滤得鱼糜肉汁，加入1.6g/L氧化三甲胺、40mg/LL-半胱氨酸和40mg/LL甲硫氨酸，混合均匀后于121℃高压灭菌15mIn，得无菌鱼糜肉汁。无菌条件下，在鱼糜肉汁中添加不同质量浓度的大蒜提取物（终质量浓度为0.15～1.20mg/mL）。将制备好的细菌菌悬液接种至无菌鱼糜肉汁中，于30℃中摇床培养48h，每间隔6h取样，测定鱼糜肉汁中TVB-n和腐胺含量变化。

TVB-n的测定参照赵丹丹等的方法，取5mL样品，加入15mL0.6mol/L高氯酸溶液均质混匀，上清液用半自动凯氏定氮仪测定。腐胺含量的测定参照Zhao等的方法，取2mL样品，加入25mL0.4mol/L高氯酸溶液均质混匀，上清液用丹磺酰氯衍生后用高效液相色谱分析。

1.4 数据统计分析

运用SPSS21.0软件和OrIgIn8.5软件分析数据。测定结果以均值±标准差（n≥3）表示，采用最小显著差异法（LSD）进行显著性差异分析，显著性水平为5%。

2 结果与分析

2.1 维氏气单胞菌产AHLs信号分子的种类

以根癌农杆菌为报告菌，利用平行划线法分析维氏气单胞菌的AHLS分子产生情况，结果见图1。细菌产生的AHLS可通过琼脂扩散诱导根癌农杆菌产生β-半乳糖苷酶，并分解底物X-gal产生蓝色色素。由图1可知，维氏气单胞菌可产生AHLS类信号分子并诱导根癌农杆菌显蓝色。

根癌农杆菌对不同碳链长度或带有不同基团的AHLS分子敏感程度不同，这些AHLS经TLc展开，在培养基相应的位置诱导根癌农杆菌呈现蓝色斑点。根据斑点的比移值、形状和颜色深、浅可直观判断AHLS的种类及相对含量。对维氏气单胞菌的AHLS提取液的TLc分析结果见图2。分析可知，该细菌至少产生3种AHLS分子，即：c6-HSL、c7-HSL和c8-HSL。c4-HSL与c6-HSL是目前气单胞菌属报道最多的2种AHLS信号分子。LI等在腐败比目鱼中分离的温和气单胞菌中检测到c4-HSL、c6-HSL、c8-HSL、N-癸酰基-高丝氨酸内酯（c10-HSL）和n十二酰基-高丝氨酸内酯（c12-HSL）。本试验在维氏气单胞菌中检测到侧链上的碳原子数目为奇数的AHL信号分子，即c7-HSL。

2.2 维氏气单胞菌生长过程中AHLs活性变化

细菌产生的AHLS分子浓度受细菌密度变化影响，不同生长阶段的细菌AHLS提取液能诱导根癌农杆菌产生不同直径的蓝色圈。维氏气单胞菌生长过程中的细菌总数与培养液PH值的变化见图3，AHLS活性变化见图4。分析可知，细菌培养4h时处于对数生长期初期，此时细菌分泌的AHLS可诱导根癌农杆菌显蓝色。在4～10h细菌的快速生长阶段，根癌农杆菌的变色直径不断增大，说明AHLS的含量快速累积。在10～18h时，根癌农杆菌蓝色圈的直径最大，此时培养液中AHLS浓度最高。在18～48h，细菌处于生长稳定期，诱导报告菌变色的直径减小，说明AHLS的浓度开始降低。研究发现，AHLS含量的减少与环境PH值升高有关。AHLS的高丝氨酸内酯环在碱性条件下结构不稳定，易解环。对细菌生长过程中培养液的PH值变化的分析表明：细菌培养18h后培养液的PH值由6.92增至8.11，培养48h时PH值达8.97。随着细菌的生长，培养液的PH值不断升高，AHLS开始降解，活性降低。

2.3 维氏气单胞菌的基因分析

革兰氏阴性菌AHLS介导的群体感应系统主要由luxRI的同源基因调控。利用PcR技术分析维氏气单胞菌中的luxRI同源基因，结果见图5a。分析发现2个片段序列分别为转录调控因子AcuR和自诱导基因AcuI，这与ＪangId等的研究结果相同，该学者首次在维氏气单胞菌mTcc3249中检测到AcuRI群体感应系统。此外，分析维氏气单胞菌的氨基酸脱羧酶基因和毒力基因，结果见图5b、5c。鸟氨酸脱羧酶基因（ODC）和赖氨酸脱羧酶基因（LDC）的检出说明该细菌具有产腐胺和尸胺的能力，胞外酶基因（AhyB，ser，liP）的检出说明该菌具有一定的蛋白酶活性和脂肪酶活性，鞭毛基因（flA）的检出说明该菌具有鞭毛运动和形成生物膜的能力。

2.4 大蒜提取物对维氏气单胞菌产AHLs的抑制作用

大蒜提取物对维氏气单胞菌的最小抑菌质量浓度为2.5mg/mL（数据未显示）。本试验选择低于此质量浓度的系列（0，0.15，0.3，0.6，1.2mg/mL）来研究大蒜提取物对维氏气单胞菌群体感应的干扰作用。

通过检测生物报告菌根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性来分析不同浓度大蒜提取物对维氏气单胞菌产生AHLS活性的干扰作用，结果见图6。分析可知，随着大蒜提取物质量浓度的增加（0～1.20mg/mL），根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性不断降低（P＜0.05）。这说明大蒜提取物对维氏气单胞菌产AHLS活性具有显著的抑制作用（P＜0.05），且大蒜提取物的质量浓度与其群体感应抑制活性呈明显量效关系。大蒜提取物质量浓度为1.20mg/mL时对根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性的抑制率最高，为39.6%。这可能是因为此质量浓度下维氏气单胞菌AcuR蛋白与群体感应抑制活性物质的结合力最强，抑制了AHLS分子的转录表达。