高效液相色谱法同时测定茶叶中6种茶多酚含量（一）

茶叶是中国传统植物来源饮品，具有悠久的饮用历史。茶叶中富含多种营养成分和挥发性物质，其主要活性物质含量随产地不同而有所差异，有效成分的种类和含量成为茶叶品质的重要评价依据。根据茶叶采集和制作形式的不同可以分为绿茶、红茶、黄茶、青茶（乌龙茶）、黑茶和白茶6大类。茶叶中最主要的抗氧化活性成分为茶多酚（Teapolyphenols，TP），茶多酚是一大类多羟基酚类化合物的总称，除此之外，茶叶中还包含有咖啡碱、氨基酸、茶多糖和维生素等营养成分。茶多酚约占茶叶干重的20%～30%，是茶叶中最重要抗氧化保健成分。茶多酚主要包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，其中主要的挥发性成分是儿茶素类化合物约占60%～80%，包括儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、没食子酸和咖啡因等。茶叶中茶多酚种类和含量随季节不同而变化，春季茶叶中表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）含量要高于秋季。茶多酚具有抗氧化、调节免疫、解毒、抗辐射和抗疲劳等多种功效，但其组成及含量随品种、采摘季节期及产地等多方面的影响。茶多酚通常从茶叶中提取，其中儿茶素类化合物占茶多酚的60%～80%，其次是黄酮类，其他酚类物质较少。

茶多酚除存在在茶叶、茶树花等多种茶树资源中。沙棘中茶多酚根据提取工艺不同含量可以达到11.3%～16.9%。茶多酚也是核桃和枇杷中活性成分。毛枝连蕊茶中绿叶和红叶植株叶片中可溶性糖、茶多酚和总花青苷。

茶多酚易溶于热水、乙酸乙酯、乙醇，微溶于油脂，难溶有机溶剂。茶多酚具有一定的吸湿性，可进行络合反应、氧化还原反应等。纳米磁珠可以实现茶多酚的快速提取分离。茶叶中茶多酚在提取过程中特别是加热时可能受到破坏，在定量分析的过程中需建立可靠的分析方法实现定量。

儿茶酚中不同成分含量是进行茶叶品质等植物鉴别的重要依据。茶多酚为多酚类物质具有天然抗氧化能力，在提取过程中可能会发生氧化还原反应，所以合适的提取工艺条件对茶多酚的定量检测至关重要。分光光度法是测定多酚类物质含量的常用方法，主要包括紫外分光光度法。主要活性成分茶多酚、总皂苷、总黄酮和总多糖。茶多酚可以采用红外光谱法进行定性和定量检测。液相色谱质谱法测定茶叶中茶多酚操作更为复杂。紫外分光光度法测定相对灵敏度较低，红外光谱法的定量测定属半定量，茶多酚中多酚类物质结构接近均为儿茶素类结构，同时茶多酚中多种活性成分物质的种类和含量以及比例对评价茶叶品质和进行其他含有茶多酚植物品种鉴别具有重要意义。

本研究利用高效液相色谱法建立了同时测定6种主要茶多酚的同时定量分析方法，该方法可以用于茶叶等植物产品中茶多酚种类及含量的检测，对植物鉴定和品质确认具有重要意义。白茶属于轻微发酵茶，绿茶属未发酵茶，均属我国六大茶品种。白茶因独特的健康价值及可陈放的特点而受到消费者和投资者的青睐，产销量与市场占有率不断攀升，2013年～2016年，全国白茶年产量连续四年保持了15%左右的增幅。不同提取条件对茶叶中主要成分的溶出有影响。本研究利用响应面法优化茶叶中不同提取方法的提取工艺，选择最优提取工艺，在此基础上利用高效液相色谱完成不同茶叶中茶多酚种类和含量定量测定，为茶叶品种和植物类型鉴别提供重要的方法学支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

没食子酸标准品（纯度均≥98%）、没食子酸儿茶素没食子酸酯标准品（纯度均≥98%）、表儿茶素标准品（纯度均≥98%）、表没食子酸儿茶素标准品（纯度均≥98%）、表儿茶素没食子酸酯标准品（纯度均≥98%）、表没食子酸儿茶素没食子酸酯标准品（纯度均≥98%），福林酚试剂（分析纯），甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、无水乙醇（分析纯），试剂均购自阿拉丁公司。白茶样品：贡眉白茶（产地福建福鼎，2018年），绿茶样品：竹叶青（产地四川）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱（Agilent1260）：安捷伦科技（中国）有限公司；分析电子天平（AR224CN）：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；超声波清洗机（SB-120DT）：上海予腾生物科技有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：上海凌科实业发展有限公司；中药材粉碎机（DFT150）：上海新诺仪器设备有限公司；紫外-可见分光光度计（UV-1800PC-DS2）：上海美谱达仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

取茶叶样品粉碎，准确称取0.5g茶叶粉碎过80目筛，干燥至恒重待用。

1.3.2 提取工艺优化

本实验利用响应面法优化茶叶中茶多酚提取工艺。

1.3.2.1 单因素实验

选取超声提取和热水浸提两种提取方法，提取时间、提取温度、固液比、溶剂浓度4个单因素，利用单因素实验确定提取条件范围。

1.3.2.2 CCD响应面法提取

根据单因素试验结果，分别选取温度、乙醇浓度、提取时间作为响应变量，变量的水平以-1、0、1表示，以茶叶提取物中总酚含量为响应值，利用软件DesignExpert8.0.6进行三因素三水平实验设计和数据分析。茶叶中茶多酚提取配方优化试验设计如表1所示。

1.3.2.3 总酚含量的测定

准确称取没食子酸标准品200mg加少量70％乙醇将样品溶化，用70％乙醇定容至100mL摇匀，静置。再用移液器吸取20mL，用70％乙醇定容至100mL，摇匀，配成浓度为400μg/mL的没食子酸标准溶液，待用。准确吸取没食子酸标准溶液0mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL于试管中。分别加入蒸馏水2.0mL、1.95mL、1.9mL、1mL、1.85mL、1.8mL、1.75mL再各加入福林试剂1mL，充分振荡后静置3～4min，分别加入10％碳酸钠1mL于25℃，摇匀置于恒温水浴中反应2h，同时做试剂空白，于765nm下测定吸光度，以含量对吸光度进行直线回归，计算回归方程。将提取液离心，取上清液，按标准曲线绘制的测定方法，依次加入试剂，以试剂空白作参比，在765nm处测定吸光度，计算茶多酚含量作为响应值。

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