沙门氏菌耐药及质粒接合转移特征（一）

沙门氏菌（Salmonella）是一种无芽孢、无荚膜的肠杆菌科革兰氏阴性直杆菌，广泛存在于人和动物肠道中，是全球范围导致食源性疾病爆发的重要病原菌之一。在美国等发达国家，沙门氏菌感染的年发病率高达15.4%，由沙门氏菌引起的疾病爆发和住院治疗均高于其他食源性细菌。在中国，每年约3亿人次因感染沙门氏菌而患病，达病原菌食源性疾病总数的70%～80%，给食品安全和消费者健康带来严重危害。

质粒是独立于染色体外、可自主复制、通常携带多种抗性和毒力基因的闭合环状双链DNA，质粒的存在可使宿主菌产生耐药性和致病性等附加特性。其中，接合质粒是一种与耐药基因水平传递和细菌耐药性获得的重要可移动元件。在众多质粒中，IncI1型质粒有助于blaCTX-M-1基因在禽类和人之间散播，IncN型质粒已被欧洲多个国家的研究者报道携带blaCTX-M-1基因。

本研究以分离于我国部分省市的食源、人源和动物源沙门氏菌为材料，筛选携带IncI1和IncN质粒的菌株，阐明IncI1和IncN质粒在沙门氏菌中的流行状况，质粒阳性菌株的药敏性、与（氟）喹诺酮抗生素耐药相关基因和超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBLs）编码基因的检出情况以及该2 种质粒通过水平转移传播耐药基因和耐药性的水平，以期为保障微生物食品安全问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

表1 菌株信息

所用菌株为实验室保存的分离于北京、上海、福建、河南、四川、广东、广西、陕西和新疆等地各类零售食品、临床病人和食品性动物的沙门氏菌（n=956）以及香港理工大学惠赠的携带IncI1（n=12）和IncN（n=2）的人源性沙门氏菌（表1）。

1.1.2 培养基

Luria-Bertani（LB）琼脂、LB肉汤、Mueller Hinton琼脂、麦康凯琼脂 北京陆桥技术股份责任公司；XLT4培养基及其补充液 美国BD公司。

1.1.3 抗生素

药敏性测定用抗生素：萘啶酮酸（nalidixic acid，NAL）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、阿米卡星（amikacin，AMK）、硫酸庆大霉素（gentamicin，GEN）、链霉素（streptomycin，STR）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、头孢曲松（ceftriaxone，CRO）、头孢西丁（cefoxitin，FOX）、头孢噻呋（ceftiofur，TIO）、头孢哌酮（cefoperazone，PER）、氨苄西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林/克拉维酸（amoxicillin-clavulanic acid，AMC）、氯霉素（chloramphenicol，CHL）、四环素（tetracycline，TET）、复方新诺明（trimethoprim/sulfamethoxazole，SXT）和多黏菌素B（polymyxin B，PB）（均为分析纯） 美国Sigma公司。

1.1.4 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物

ESBLs编码基因（blaTEM、blaCTX-M、blaOXA、blaACC和blaPSE）和质粒介导的（氟）喹诺酮耐药相关基因（qnrA、qnrB、qnrS、acc(6’)-Ib和qepA）扩增引物，IncN和IncI1不相容群质粒PCR复制子分型用引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.1.5 试剂

1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）、5×TBE缓冲液、琼脂糖凝胶、dNTP、PCR buffer、MgCl2、rTaqTM DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker 宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 仪器与设备

Mycycler PCR仪、DNA电泳和凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；Milli-Q纯水仪 法国Millpore公司；磁力加热搅拌器 美国Fisher公司；微波炉 广州美的微波炉制造有限公司；-40 ℃低温冰箱、-80 ℃低温冰箱日本Sanyo公司；百分之一天平、万分之一天平 德国赛多利斯公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海申安高压仪器设备有限公司；隔水式恒温培养箱 北京科伟实验仪器有限公司；移液器、高速离心机 德国Eppendorf公司；生物安全柜 美国Labgard公司；超净工作台苏州净化设备有限公司；浊度仪 美国DADE Behring公司；数显恒温水浴锅 北京科伟试验仪器有限公司；恒温摇床 上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 IncI1和IncN质粒分型

基于PCR复制子分型方法对质粒进行不相容群分析，用单一PCR法筛选携带IncI1和IncN不相容群质粒的菌株。采用煮沸法制备DNA模板。PCR条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性1 min，相应退火温度条件下1 min、72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min。退火温度由相应基因的引物序列决定。2 μL PCR产物经凝胶电泳和溴化乙锭染色后于凝胶成像系统下检测。在低温条件下将PCR粗产物送至上海桑尼生物科技有限公司测序，采用在线比对软件BLAST进行比对，确定质粒类型。

1.3.2 药敏性测定

采用美国国家临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institution，CLSI推荐使用的琼脂稀释法，测定供试抗生素对沙门氏菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations，MIC），参考CLSI的标准解读药敏性测定结果。

1.3.3 耐药基因检测

采用普通PCR检测相关耐药基因，引物如表2所示，PCR模板（菌株总DNA）、扩增体系和具体条件

1.3.1节所示。

1.3.4 质粒膜接合实验

基于IncI1和IncN质粒阳性菌株及受体菌药敏性结果，选择分别携带IncI1质粒和IncN质粒的沙门氏菌作为供体菌，不含该2 种质粒的大肠杆菌和沙门氏菌为受体菌，采用膜过滤法进行接合。接合方法如下：取OD600 nm为0.6的供体菌和受体菌菌液各1 mL于5 mL LB肉汤中混匀，转入孔径0.22 μm的滤器过滤，过滤后将滤膜紧贴于不含抗生素的LB琼脂培养基表面，有菌的一面向上，37 ℃过夜培养。用5 mL LB肉汤清洗过夜培养的滤膜，梯度稀释后分别涂布于同时含有CRO（32 μg/mL）和CIP（16 μg/mL）或同时含有STR（64 μg/mL）和CIP（16 μg/mL）的LB平板上，双抗平板的选择根据供体菌和受体菌的耐药表型确定，每个梯度3 个平行，37 ℃培养48 h，计数。

将OD600 nm为0.6的受体菌梯度稀释后均匀涂布于不含抗生素的LB平板，每个梯度3 个平行，37 ℃培养过夜，计数，用于菌液起始浓度的确定。同时，将供体菌和受体菌分别涂布于相应的双抗平板上，每株菌3 个平行，37 ℃培养48 h，作为对照。培养结束后，确定供体菌和受体菌不能在相应的双抗平板上生长时，再在涂布有不同稀释度接合子的双抗平板上随机挑选10 个单菌落，以表2中的引物进行PCR扩增，扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶进行电泳和测序分析，确定IncI1和IncN质粒在接合过程发生了水平转移。接合子携带的耐药基因和药敏性检测方法同1.3.1节和1.3.2节。接合频率计算公式如下：

式中：T为阳性接合子平均菌落数；R为受体菌平均菌落数。

1.4 数据统计分析

利用Minitab®18.1对实验数据进行处理，用χ2检验比较不同条件下的检出率，P＜0.05，差异显著。

相关链接：沙门氏菌，β-内酰胺酶，抗生素，硫酸庆大霉素，环丙沙星，多黏菌素B，菌株，伟业计量

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