比较两种大孔树脂动态分离多种甜菊糖苷的研究（一）

甜叶菊（又名甜菊叶、甜茶、甜菊草等），拉丁名Steviarebaudiana（Bertoni）Hemsl。原产于南美巴拉圭与巴西山脉交界处，近年来被引进中国江苏、山东、福建等多地种植。最早在《中草药》中就有记载，甜叶菊味甘、怀平，主消渴与高血压病。其使用部位为叶与茎，一年中春夏秋三季均有生长，种植环境要求不高，是较容易得到的甜味剂生产原料之一。甜菊糖苷是从甜叶菊中制得的成品，具有甜度高且热量低的优点，目前正逐渐开始代替蔗糖、白糖等甜味剂。且有大量研究表明，甜菊糖苷的二次产物甜菊醇/异甜菊醇可以通过降低肝脏糖异生基因的表达、激活肝脏与肌肉中磷酸化酶、拮抗胰岛素等作用参与体内糖代谢过程，对治疗二型糖尿病产生积极作用。

大孔树脂是表面具有多个孔洞的空心球形颗粒物，属于高分子材料，具有相互吸附与分子筛的物理原理，常用于污水处理中，现今也常被用于生产原料中有效成分的纯化与分离，分为极性与非极性两种，现市面上常见的分离纯化用树脂多为进一步结构改性树脂，甜菊糖苷专属树脂即非极性改性树脂。以往甜菊糖苷的相关研究都只是以含量最高的RA和STE为主，却并未对其他几种甜菊糖苷进一步的探究说明，而本实验用LX-T28与LX-T81两种非极性改性大孔树脂分别对包括RA与STE在内的七种甜菊糖苷进行吸附/解吸研究，主要目的在于为工业生产甜菊糖苷产品时选用树脂材料提供参考依据，并对甜叶菊的基础研究作一定的补充说明。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；SW-LB32T微量折光糖度计（上海圆迈贸易有限公司）；BT100-8数显恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司）；SHZ-82气浴恒温振荡器（江苏省金坛市中大仪器厂）；1.6×16cm玻璃中低压层析柱（上海联塔仪器有限公司）；ThermoMicroPico17微量台式离心机（美国THERMOSCIENTIFIC公司）；TE602-L电子分析天平（Sartorius公司）；0.22μmPTFE微孔滤膜和Nylon60.22μm微孔滤膜（天津市科亿隆实验设备有限公司）；50μL进样针（上海安亭微量进样器厂）。

1.2 试剂与药物

95%可食用乙醇（镇江华东器化玻有限公司）；乙腈、甲醇有机试剂均为HPLC级（国药集团有限公司），水为纯水/纯净水（哇哈哈牌）；标准品：RD（≥98%，DST190402-069，成都德思特生物技术有限公司）、Rf（≥98%，DST190802-074，成都德思特生物技术有限公司）、RA（≥98%，PSO945-O025，成都普思生物科技股份有限公司）、STE（≥98%，PS1416-O025，成都普思生物科技股份有限公司）、RC（≥98%，PS0946-O025，成都普思生物科技股份有限公司）、DA（≥98%，19011422，上海同田生物技术股份有限公司）、Rub（≥98%，18112123，上海同田生物技术股份有限公司）；精制的甜菊糖苷粉末（≥95%，20181201，江苏华晶生物科技有限公司）；大孔吸附树脂LX-T28、LX-T81（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）。

2 实验方法

2.1 检测方法

2.1.1 HPLC定性与定量检测

色谱条件：色谱柱LunaC18（2），250*4.6，5μm，（00G-4252-E0）；32%乙腈+68%水为流动相；DAD检测器，210nm检测波长；0.5mL/min流速；20μL进样体积；30℃柱温。

2.1.2 标准曲线

分别配制甜菊糖苷RD、RA、STE、RF、RC、DA、Rub的标准品溶液100、200、300、400、500、600μg/mL，并混合成具有各糖苷的混合标准品溶液。在HPLC色谱条件下分别测定峰面积响应值，绘制浓度（μg/mL）-峰面积曲线图，分别得到各糖苷标准曲线的回归方程：

RD：y=6.8806x-17.180，r²=0.9982/r=0.9991

RA：y=8.1894x-75.987，r²=0.9987/r=0.9993

STE：y=10.706x-39.765，r²=0.9991/r=0.9995

RF：y=7.2153x-16.006，r²=0.9974/r=0.9987

RC：y=8.0646x-35.212，r²=0.9997/r=0.9998

DA：y=11.086x-6.0582，r²=0.9988/r=0.9993

Rub：y=11.240x-14.160，r²=0.9986/r=0.9992

2.2 树脂的预处理

LX-T28与LX-T81两种树脂分别先用1～2BV95％可食用乙醇进柱，流速1～2BV/h，浸泡过夜；随后再用1～2BV95％可食用乙醇洗脱至洗出液与水的混合液（1∶2）不再浑浊，再水冲洗树脂床直至无醇味即可投入使用。

2.3 静态吸附

分别称取预处理后的两种湿态树脂（沥干至无水滴落状，1BV≈22mL）1g，各加入35mL15mg/mL的甜菊糖苷水溶液（精制的甜菊糖苷粉末配制），在室温（25℃）下中低速度震荡24h后，HPLC测定上清液的成分及含量，计算树脂的静态吸附当量。

2.4 静态解吸

将‘2.3’中吸附饱和两种湿态树脂用纯水清洗尽残留的甜菊糖苷溶液，再各加入35mL55%乙醇（95%可食用乙醇配制），在室温（25℃）下中低速度震荡24h后，HPLC测定上清液的成分及含量，计算该洗脱剂下的解吸量。

2.5 静态吸附动力学曲线

分别称取预处理后的两种湿态树脂（沥干至无水滴落状）1g，各加入35mL15mg/mL的甜菊糖苷水溶液（精制的甜菊糖苷粉末配制），在室温（25℃）下中低速度震荡25h，收集1、2、4、6、8、11、25h的上清液，HPLC测定上清液的成分及含量，绘制树脂的静态吸附动力学曲线。

2.6 静态解吸动力学曲线

将‘2.5’中吸附饱和两种湿态树脂用纯水清洗尽残留的甜菊糖苷溶液，再各加入35mL55%乙醇（95%可食用乙醇配制），在室温（25℃）下中低速度震荡24h，收集1、2、4、6、8、11、25h的上清液，HPLC测定上清液的成分及含量，绘制树脂的静态解吸动力学曲线。

2.7 泄露曲线/动态吸附曲线

分别称取20g湿态树脂，湿法装填入1.6×16cm的层析柱中。配制15mg/mL浓度甜菊糖苷水溶液，以2BV/h流速上样，每15min（即0.5BV）收集一次流出液，HPLC检测每次流出液，当流出液的浓度达上样溶液浓度的10%时的上样体积即为即为饱和上样体积。

2.8 动态解吸曲线

将‘2.7’中吸附饱和的树脂，中水冲洗干净残留的上样液后，2BV/h洗脱流速，2BV55%乙醇进柱洗脱（洗脱剂用完后用纯水顶出管路中的解吸液），每15min（即0.5BV）收集一次流出液，HPLC检测每次流出液，检测洗脱液浓度至‘0’时，达到完全解吸的洗脱体积。

2.9 单柱分离

两种树脂分别装填在1.6×16cm层析柱中。配制15mg/mL浓度甜菊糖苷水溶液，以2BV/h流速上样，待树脂床吸附饱和后，中水冲洗干净残留的上样液，以2BV/h洗脱流速，2BV55%乙醇进柱洗脱（洗脱剂用完后用纯水顶出管路中的解吸液），每3min收集一次流出液，HPLC检测每次流出液，分析几种甜菊糖苷的出柱先后顺序。

3 结果与分析

3.1 树脂性能参数比较

就工业生产来说，树脂的吸附当量与产品产量呈正相关趋势，因此树脂的吸附能力常作为评价树脂性能的主要指标。通过比较两种树脂的静态吸附当量，以评价树脂对于不同甜菊糖苷的吸附性能与综合吸附性差异。树脂性能参数的差异见下表1。

从表1可以看出，LX-T81对以上七中甜菊糖苷的静态吸附当量均高于LX-T28，性能更优。其中差异最显著的是含量最高的RA和STE，分别是1g树脂可以吸附166.05mg和72.33mg。此外，同种树脂对不同甜菊糖苷的吸附能力也有较为明显的差距，这种现象主要源于几种甜菊糖苷在精制甜菊糖苷粉末中的含量差异，还包括不同甜菊糖苷的分子量、所带糖基种类与数目的差异，等等因素，综合影响树脂的吸附能力。

3.2 吸附动力学曲线

实际工业生产中，除了目标产物的产量，吸附速度即达到树脂吸附饱和的时间快慢，也是评价树脂性能的重要参数之一，见下图1。

从图1可以发现，LX-T28与LX-T81的树脂吸附动力学曲线的变化趋势几乎完全一致。表现在0～2h内七种甜菊糖苷的吸附当量随时间增加而变大，而在2h后吸附当量都趋于稳定，说明两种树脂均为较高效的吸附树脂，达到吸附饱和的时间相近，而曲线中斜率（吸附速度=吸附当量/时间）则表明LX-T81吸附速度稍快于LX-T28。此外，在0～2h内，可以明显发现七种甜菊糖苷的吸附速度均有较为明显的差异，依次是RA最快，随后是STE、RC、RF、Rub、RD，DA最慢。

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