硬脂酸修饰的燕麦多糖自聚集胶束的制备及其特性初探（二）

发布时间：2021-09-01 19:58 编辑者：特邀作者周世红

1.2.6 OGE的临界聚集浓度

临界聚集浓度的测定利用荧光探针法，方法参照文献并稍作修改。准备称取芘标准品配制浓度为3×10^-4mol/L的芘甲醇溶液。取10mL的具塞试管，每管中加入3×10^-4mol/L的芘甲醇溶液20μL后，用氮气将溶液中的甲醇吹干。选取不同取代度的OGE，再向每管中加入10mL不同取代度、不同浓度（0.0002～3mg/mL）的OGE溶液，此时芘的最终浓度为6×10^-7mol/L，室温下避光高速搅拌5h后，利用荧光分光光度计测定芘的发射光谱。测定条件：激发波长330nm，发射和激发狭缝均为5nm，发射光谱的扫描范围350～500nm。记录I₁（374nm）和I₃（385nm）处的荧光强度。以OGE浓度的对数为横坐标，I₁/I₃的值为纵坐标绘制散点图，并进行曲线拟合后，求两拟合曲线交点处的横坐标，换算成浓度，此时的浓度即临界聚集浓度。

1.2.7 OGE的溶解度

称取一定取代度的OGE，配制成2.0mg/mL的溶液，将溶液于100℃下加热15min后取出，离心20min（3000×g），收集上清液烘干称重，并记录，按式（2）计算其溶解度。

1.2.8 OGE的细胞毒性分析

从液氮罐中取出装有Raw264.7细胞的冻存管1支，37℃水浴复苏、传代、定期换液等工作。试验开始前加入新鲜DMEM高糖培养基（含10%FBS）制成细胞悬液，1000×g离心5min后，弃上清后，加入新鲜培养液，悬浮细胞计数。将细胞浓度调成3×10⁴个/孔的密度，以100μL/孔接种于96孔细胞培养板中。置于37℃，5%CO₂培养箱中过夜，使细胞充分贴壁，弃上清后，以100μL/孔加入不同浓度（25，50，100，200μg/mL）的OGE溶液至各孔中，每组设置6个重复孔。在37℃，5%CO₂培养箱中培养24h后，加入10μLCCK-8液，再放入细胞培养箱中培养2h左右，在波长450nm处测定吸光值（OD值）。

式中，A₁—试验孔吸光值（OD值）；A₂—对照空吸光值（OD值）；A₀—空白孔吸光值（OD值）。

1.2.9 数据处理

本试验各数据采用“平均值±标准偏差”表示。利用MestReNova软件进行NMR图谱数据处理，SPSSStatistics24统计学软件进行正交试验设计及结果分析，采用单因素方差分析进行各组间指标差异比较，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 燕麦β-葡聚糖硬脂酸酯（OGE）的制备

2.1.1 硬脂酸活化液添加量对取代度的影响

有报道称，脂肪酸酯化多糖的反应是可逆的。因此，硬脂酸酰基咪唑的增加促使该酯化反应向正方向不断进行。从图1可以清晰地看出，随着硬脂酸酰基咪唑添加量不断增加，产物取代度也不断增加。推测由于随着硬脂酸酰基咪唑添加量的增加，燕麦β-葡聚糖与酰基咪唑之间的碰撞频率也随之不断增大，使得整个体系中的酯化效率相应提高。继续添加硬脂酸酰基咪唑时，硬脂酸酰基咪唑与燕麦β-葡聚糖中的羟基基团发生的反应也慢慢趋于饱和，反应速率减缓，取代度的增加趋势也变得较为缓慢。

2.1.2 反应温度对取代度的影响

图2是酯化反应温度对产物取代度的变化图，其中，当反应体系的温度从70℃升至80℃时，酯化产物的取代度从0.036增加至0.057后，继续升高体系的反应温度，对酯化反应的影响不是很大，取代度数值变化较小，并趋于平缓。可能由于温度升高，大分子链的活性也相应增强，促使反应体系中分子间的有效碰撞次数增加，取代度随之发生变化。当反应体系中参与反应的分子达到饱和时，有效碰撞的次数不再增加，取代度的变化也趋于稳定。

2.1.3 反应时间对取代度的影响

根据酯化反应的理论分析结果，酯化反应会随着时间的延长逐渐达到一个极限值。如图3所示，随着酯化反应时间的持续延长，取代度相应升高，燕麦β-葡聚糖的酯化反应也越充分。酯化反应在4.5h前，由于体系中生成的OGE浓度较低，使得体系中的酯化反应能够持续进行。而当整个体系在反应进行到5.0h时，产物的取代度增长幅度变得缓慢，此时反应体系中的酯化反应与分解反应即将平衡。因此，反应时间并不能无限延长下去。

2.1.4 OGE制备条件的优化

利用SPSSStatistics24软件进行正交试验设计，采用3因素3水平进一步研究硬脂酸活化液添加量（A）、反应温度（B）和反应时间（C）对OGE取代度的影响，确定出OGE的最佳制备条件。

从表1中可以清楚的得到此反应中OGE的最佳制备条件，即当硬脂酸酰基咪唑添加量为6.50mL，反应温度为90℃，反应时间为5.0h时，有最大取代度，为0.133。

2.2 OGE的外观形态及粒径

分别配制1mg/mL的燕麦多糖溶液和同质量浓度的OGE溶液作对比可以看出，OGE溶液更为浑浊，且上层有很多泡沫存在，而燕麦多糖溶液则清澈，且几乎无泡沫存在。推测是由于在原燕麦β-葡聚糖中接入了硬脂酸，硬脂酸本身具备乳化、稳定及润滑作用有可能也带入到OGE中，使得OGE液体上方出现诸多泡沫。

据相关报道，两亲性多糖在较低浓度下能够形成壳核结构的自聚集胶束，纳米胶束的外观形态大多呈球状。如图5所示，OGE在扫描电镜下可以清晰地看出其外观形态为球形，较原燕麦β-葡聚糖的粒径更小，大小更为均一。原燕麦β葡聚糖有干瘪状的球形，而经过改性后的两亲性多糖更加饱满。

大多数两亲性多糖形成的胶束的PDＩ都非常窄。PDＩ值越小表示粒径分布越窄，颗粒大小越均一。有研究表明，当PDＩ＞0.7时，代表颗粒的粒径分布较宽。正如表2所示，OGE的PDＩ＜0.7，可认为OGE的粒径大小较为均一，与扫描电镜呈现的表观形态一致。然而在不同取代度下，OGE的粒径大小也存在差异，随取代度的增加，OGE的粒径大小反而降低。可能由于OGE本身形成的胶束体系中，不同取代度下的比表面积和表面能的差异，导致自发的粒子聚集程度不同所致。疏水改性后的多糖相比较原糖来说，即取代度为0时，粒径更小，其PDＩ值也越小。