氨基甲酸乙酯降解酶的固定化研究（三）

2.2.3 固定化EC降解酶的乙醇耐受性

EC降解酶的乙醇耐受性在酒精饮料的应用中非常重要。从图6可以看出，随着乙醇体积分数的升高，游离酶和固定化EC降解酶酶活均随之下降，但固定化EC降解酶对乙醇表现出良好的耐受性。在乙醇体积分数为7％～25％时，同定化EC降解酶酶活均能保留50％以上.同游离酶的乙醇耐受性相比，变化有一定差异，初步推测此固定化方法对其乙醇耐受性和酶活提高有一定影响。说明此固定化EC降解酶与游离酶相比，在乙醇体积分数相对较低时可以保持相对较高的酶活，适用于乙醇体积分数相对较低的发酵酒精饮料。

2.2.4 固定化KC降解酶的重复使用性

如图7所示，在模拟酒样对固定化EC降解酶进行重复性实验，结果显示，每次使用后酶活均有下降。当重复使用8次以后，固定化EC降解酶酶活力保留在50％以上，因此在8次前使用效果较好。

此结果与文献报道的GO-CS复合同定酸性酶使用10次时的酶活80％相比，可使用次数稍显劣势圈，但就所得固定化酶而言，仍然可以考虑将使用次数尽量控制在8次以内以获得更好的效果。

2.2.5 固定化EC降解酶的储存稳定性

固定化EC降解酶在不同储存温度随贮藏时问的酶活变化如图8所示。在4℃条件下，酶活随时问逐渐降低，酶活降低速率在1～3周和4～6周的变化都较平稳，而在3～4周的变化最大：且贮藏6周之内，酶活损失不足30％。在20℃条件下，酶活随时间延长逐渐降低，至第5周时基本保持不变，但在贮藏6周之后，酶活仅达到60％。说明贮藏温度对同定化EC降解酶的酶活有一定影响，但不是唯一因素。因此在该实验条件下，尽量将固定化酶保藏在4～20℃，但基于固定化酶最适反应温度和出于经济节约方面的考虑，以20℃作为最佳贮藏温度条件。

2.3 固定化酶对“美乐”葡萄酒的影响

2.3.1 固定化酶在“美乐”葡萄酒中的稳定性

如图9所示，随着静置时间增加，游离酶和固定化EC降解酶酶活均呈现下降趋势，但存整个过程中，固定化酶酶活均高于游离酶酶活。当静置96h时，固定化酶酶活与游离酶酶活相差最大，相较于起初酶活差异，后期的差异更大，可能是南于相同酶量的条件下，起初游离酶更容易与底物接触，而随着时间推移，固定化酶由于载体的保护作用，仍能慢慢显示出较高的酶活性。静置144h之前，固定化酶酶活的损失率在50％以下，说明此酶可以适应“美乐”葡萄酒的微环境，用于葡萄酒中EC的去除。

2.3. 2固定化酶对“美乐”葡萄酒中EC的去除率

“美乐"葡萄酒样品中添加等量酶活的固定化EC降解酶和游离酶一段时间后，样品中EC质量浓度逐渐降低。

从图10可以看出,样品中加酶处理后,处理组的EC质量浓度均低于对照组，处理组的EC去除率高于对照组，说明无论是游离还是固定化EC降解酶的处理,均使“美乐”葡萄酒中EC质量浓度得到了降低，但游离酶酶法去除EC的效果要优于固定化酶处理法。在该实验条件下,固定化EC降解酶对“美乐”葡萄酒中EC的去除率可达30.90%,是游离酶的81.53%。

2.3.3 固定化酶对“美乐”葡萄酒挥发性物质的影响

葡萄酒的风味不是独立存在的，而是由醇、酯、酸、醛、酮、萜类化合物和C13-萜烯类化合物相互协调而产生的，它们共同构成了葡萄酒香气的组成成分。对“美乐”葡萄酒中香气化合物及其相对含量进行了定性和定量分析。

对照组和处理组的葡萄酒中挥发性风味物质的相对含量如表1所示，在3种处理方式下的葡萄酒巾，共检测到29种香气成分，包括12种酯类、9种醇类、3种有机酸和5种醛、酮、酚类。经分析可知，不同处理组中各挥发性物质的相对含量之间无显著差异，但是相较于对照组，处理组的物质种类均有所减少，其中固定化酶处理组减少了8种物质，而游离酶处理组减少了12种物质。说明酶处理对葡萄酒巾挥发性物质的种类数量有些许影响，但对化合物的相对含量影响不显著，而且，固定化酶处理方式对葡萄酒更加友好。相比对照组.酶处理组中的物质均出现了数量的减少，但消失的物质并不相同，固定化酶处理组减少的物质包括：香茅醇、正癸醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯和异丙醇。而游离酶处理组减少的物质分别是香茅醇、卢一大马士酮、糠醛、正癸醛、己酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯、2，3一丁二醇、异丙醇、1一己醇。说明不同类型的酶处理对葡萄酒的影响不同，但考虑到游离酶引起芳香味和果香味物质的损失更大，F向于在考虑风味复杂性时要避免不愉快风味的发展，因此建议对“美乐”葡萄酒使用固定化EC降解酶进行处理。

此外，不同处理组测得的挥发性风味化合物的组成也有明显不同。表1和图11显示了“美乐”葡萄酒中不同酶处理方式下主要挥发性香气成分(醇、酯类、酸和醛)的变化规律。

南C6化合物、挥发性酚类物质和苯类化合物组成的香气成分在“美乐”葡萄酒中随着酶处理方式的不同而呈现出不同的趋势。酶处理后醇类和醛类占比降低，而酯类和酸类均有所增加，其他类基本保持不变，表明不同的酶处理方式对挥发性香气化合物产生了一定影响。尽管酶处理方式对葡萄酒巾挥发性物质的相对含量没有显著影响，但引起了香气物质种类的减少和香气成分的改变，且游离酶对其不利影响要大于同定化酶。因此，在人们接受风味有所改变的前提下，同定化EC降解酶更适合用于“美乐”葡萄酒。

3 结语

通过对壳聚糖与戊二醛的交联条件进行优化后发现，以体积分数5％的戊二醛溶液作交联剂，交联反应进行8h时，载体对酶的固定量达到最大。之后对EC降解酶的酶学性质展开分析，得到如下结果：固定化EC降解酶的最适温度是42℃，在此温度下放置24h时相对酶活达60％以上；其最适DH是3.6，在此条件下放置24h的相对酶活大于60％：在体积分数7％～25％乙醇下，酶活均保持在50％以上，说明该固定化酶的乙醇耐受范围广，催化活性高：该酶在重复使用8次后，酶活还保持在50％以上.而且分别在4℃和20℃下贮藏6周后的酶活损失率不足30％币H40％。最后，采用ATPS结合GC-MS检测不同酶处理的“美乐”葡萄酒中含有的EC，得知同定化EC降解酶的EC去除率达30.90％，是游离酶的81.53％。EC降解酶的处理方式对葡萄酒中挥发性物质的相对含量没有显著影响，只是引起了香气物质种类的减少和香气成分的改变，但固定化酶对挥发性风味物质的不利影响远低于游离酶。

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