一株高产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离及产酶优化条件（二）

1.2.5 纤维素酶活力的测定

分离菌株接种至LB液体培养基中，37℃培养24h，连续传代至第3代时获取发酵液，离心取上清液，即为菌株的粗酶液。CMC（羧甲基纤维素）法测定菌株所产纤维素酶的活力。纤维素酶活力定义为1mL酶液在50℃条件下1min水解羧甲基纤维素产生1μg葡萄糖即为1个酶活力单位（U/mL）。
 

其中：m：从标准曲线回归方程计算得的葡萄糖毫克数；n：酶液稀释倍数；0.5：测定时吸取稀释酶液毫升数；30：表示反应时间分钟数。

2 结果与讨论

2.1 纤维素酶活性菌株的筛选

从9个样品中共分离出21株菌，全部为革兰氏阳性细菌，经CMC-Na固体培养基培养，刚果红染液染色筛选，其中有5株细菌可在CMC-Na固体培养基上形成透明圈菌落，结果如图1所示。W1和W2菌株，来源于纳豆样品W，R菌株来源于纳豆样品R，F3菌株来源于豆豉样品F，FS来源于豆豉样品FS。其中，以F3菌株水解CMC-Na的能力最强，即纤维素酶活性最高，FS菌株的活性最低。因此，选取来源于发酵豆豉的F3菌株做进一步研究。

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 形态学特征

F3菌株于LB固体培养基中37℃培养24h，菌落及革兰氏染色观察结果如图2所示。F3菌株可在LB固体培养基上形成乳白色、不透明、边缘不规则的圆形菌落，表面光滑，隆起，质地黏稠拉丝。菌体细胞为革兰氏染色阳性，呈短杆状，两端钝圆，单个排列，可形成明显的芽孢。

2.2.2 16SrDNA基因序列分析

F3菌株的16SrDNA基因经测序获得序列长度为1437bp，通过BLAST分析，发现菌株F3与芽孢杆菌属同源性最高，随后将其与芽孢杆菌属内模式菌株的16SrDNA基因序列进行多序列比对分析，同时以非同属的Escherichiacoli模式菌株为外标，并利用NeighborJoining法构建系统发育树，结果如图3所示。

由16SrDNA基因序列比对分析可知，F3菌株与Bacillusamyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciens、Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum两个模式菌株的亲缘关系最近，但两个模式菌株的16SrDNA基因序列经两端对齐比对分析发现二者同源性大于99.5%，故无法判定F3菌株具体种的归属。对于亲缘关系较近的种间鉴定仅通过16SrDNA基因序列分析是无法实现的，需在其基础上借助于其他特定看家基因序列构建系统发育树进行联合分析，如gyrA、gyrB、recA、pheS、rpoA等。

2.2.3 gyrB基因序列分析

为了进一步鉴定F3菌株，对其gyrB基因进行了PCR扩增及测序，获得了gyrB基因的部分序列，长度为1115bp。将该菌株的gyrB基因序列同已知芽孢杆菌属内不同模式菌株的gyrB基因序列进行比对分析，同样以非同属的Escherichiacoli模式菌株为外标，绘制基于gyrB基因的系统发育树，如图4所示。

解淀粉芽孢杆菌植物亚种与解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种的gyrB基因序列同源性仅约为96%，而基于gyrB序列比对分析发现F3菌株与解淀粉芽孢杆菌植物亚种亲缘关系更近。因此，基于16SrDNA和gyrB基因序列比对分析，可将F3菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌植物亚种。

声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：纤维素酶，芽孢杆菌，革兰氏染色，羧甲基纤维素