一株高产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离及产酶优化条件（一）

纤维素酶（Cellulase）是一种可降解纤维素生成葡萄糖的酶类，其作为重要的工业酶广泛应用于食品、纺织、生物燃料等领域。近年来工农及医药业得到了飞速发展，但同时也产生了大量的产业废弃物，随着全球环境污染问题的愈发严重，这些废弃物的合理利用已成为当前解决环境问题的焦点，如富含纤维类物质的果蔬加工副产物、中药加工残渣及农作物秸秆等的再利用，利用纤维素酶处理已成为重要的解决途径之一。纤维素酶的来源广泛，如网翅目、直翅目、鞘翅目等昆虫体内的消化液，以及微生物的代谢产物等，其中以微生物来源纤维素酶报道最多。可产纤维素酶的微生物主要来源于动物及昆虫的消化道，土壤及泉水、湖水的沉积物，青贮饲料，酒醅和窖泥，以及豆豉、黄豆酱、发酵茶等传统发酵食品，这些微生物主要包括细菌、放线菌、酵母菌以及霉菌，其中不可培养的微生物也可能是纤维素酶的重要来源，故研究人员利用宏基因组技术从环境中筛选纤维素酶基因，并在可体外培养的大肠杆菌中表达以获取性能优良的纤维素酶，为纤维素酶的资源挖掘开辟了新途径。此外，纤维素酶及纤维素酶活性微生物对加工食品的品质及活性成分的提取具有重要的改善作用。本文拟从自然环境及发酵食品中分离筛选高活性纤维素酶产生菌株并优化其产酶条件，旨在丰富纤维素酶活性微生物菌种资源库，并为发酵食品生产、富含纤维素类废弃物的合理利用提供菌种资源，同时也为工业用菌种的开发及其理论研究提供数据支持。

土壤、发酵豆制品（纳豆、豆豉）被用作筛选纤维素酶活性菌株的样品来源。共采集5个土壤样品，命名为1、2、3、4、5，来源于黑龙江中医药大学校园内花草及树木周围土壤；纳豆W：北海道はまなす食品株式会社；纳豆R：株式会社ヤマダイフ一ズプロセシング小樽工場；豆豉F：重庆市永川豆豉食品有限公司；豆豉FS：广东阳江豆豉有限公司。

1.1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨1.0g，酵母粉0.5g，氯化钠1.0g，蒸馏水溶解至100mL，自然pH，121℃灭菌15min。固体培养基加入1.8%～2.0%琼脂粉；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）固体培养基：CMC-Na1.0g，蛋白胨1.0g，酵母粉0.1g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.04g，氯化钠1.0g，琼脂粉1.6g，蒸馏水溶解至200mL，pH调至pH7.0～pH7.2，121℃灭菌15min。

1.1.3 主要试剂

刚果红：北京博奥拓达科技有限公司；3，5-二硝基水杨酸：天津市致远化学试剂有限公司；酒石酸钾钠：天津市鑫铂特化工有限公司；亚硫酸钠：天津市光复精细化工研究所；苯酚：天津市致远化学试剂有限公司；葡萄糖：天津市北辰方正试剂厂；柠檬酸：天津市光复科技发展有限公司；羧甲基纤维素钠：天津市天力化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302-02）：天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.4 主要设备

SW-CJ-2D双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；DY04-13-43-00（LS-30）压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；XMTD-204数显式电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械有限公司；ME203E电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；BSD-100培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SP-752（PC）紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；PB-10酸度计：赛多利斯科学仪器有限公司；H1650台式高速离心机：湘仪集团；T100-PCR仪：Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 产纤维素酶菌株的分离及筛选

称取5.0g采集样品，无菌条件下分别接种至50mLLB液体培养基，37℃恒温培养24h，10倍梯度稀释发酵液，取适当浓度稀释液涂布于LB固体培养基，37℃培养24h，挑取在形态学上存在差异的单菌落，进一步划线于LB固体培养基中培养，如此重复直至纯化。

将已纯化分离菌株分别接种至CMC-Na固体培养基中，37℃培养24h，随后向长有菌落的CMC-Na固体培养基上加入0.2%刚果红染液染色30min，再依次用蒸馏水和1mol/LNaCl溶液洗掉染液，周围可见透明圈的菌落被认为具有纤维素酶活性，透明圈与菌落直径的比值越大，纤维素酶活性则越高。选取纤维素酶活性最高的菌株做进一步菌种鉴定。

1.2.2 菌株的鉴定

1.2.2.1 形态学特征

选取初筛获取的纤维素酶活性最高菌株，37℃培养于LB固体培养基24h，记录其菌落形态特征，并进行革兰氏染色观察其菌体细胞形态。

1.2.2.2 16SrDNA基因序列分析

提取菌株基因组DNA，并以其为模板进行16SrDNA基因序列扩增，扩增引物及条件参照文献。正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1541R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。PCR扩增条件：95℃变性5min；94℃1min，58℃1min，72℃2min，30个循环；72℃延伸7min。PCR反应体系（50μL）：2×TaqPCRMasterMix25μL，正向引物（10μmol/L）1μL，反向引物（10μmol/L）1μL，DNA模板2μL，ddH2O21μL。PCR扩增产物送到华大基因（北京）进行测序。菌株的16SrDNA基因序列经BLAST比对分析，确定与其亲缘关系最近的属，并基于16SrDNA基因序列利用MEGA5.1软件构建菌株与该属内模式菌株的系统发育树，进而确定该菌株的种属。

1.2.2.3 gyrB基因序列分析

由华大基因合成gyrB基因的PCR扩增引物（UP-1和UP-2r）及测序引物（UP-1S和UP-2Sr）。正向扩增引物UP-1：GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，反向扩增引物UP-2r：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT；正向测序引物UP1S：GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA，反向测序引物UP-2Sr：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC。PCR反应体系及扩增条件参照文献。PCR扩增条件：95℃变性4min；98℃10s，62℃1min，72℃2min，30个循环；72℃延伸8min。PCR反应体系（50μL）：2×TaqPCRMasterMix25μL，正向引物（10μmol/L）2μL，反向引物（10μmol/L）2μL，DNA模板1μL，ddH2O20μL。

1.2.3 培养条件对菌株纤维素酶活力的影响

依次考察不同发酵条件对菌株产纤维素酶活力的影响，包括培养时间（12h、24h、36h、48h、60h、72h）、培养温度（33℃、35℃、37℃、39℃、41℃）、培养基初始pH（pH3.0、pH5.0、pH7.0、pH9.0、pH11.0）和接种量（2%、4%、6%、8%、10%）共4项指标。

1.2.4 纤维素酶活性优化的正交试验设计

根据单因素试验结果，针对每个因素分别选取3个水平，以纤维素酶活力为评价指标，进行L₉（3⁴）正交试验，从而确定菌株发酵产纤维素酶的最佳发酵条件，试验因素与水平如表1所示。

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