乳清蛋白粗提粉对斑马鱼骨质疏松症的药效研究（一）

骨质疏松症是一种以单位体积内患者的骨量减少为主要特点的代谢性骨病，主要发生在中老年人群。疼痛是骨质疏松患者的主要临床表现，其次为身长缩短、驼背、骨折及呼吸系统障碍等，严重影响患者的生活质量。

乳清蛋白是利用现代工艺技术从牛乳中提取出来的一类蛋白质，含有大量的免疫球蛋白、乳铁蛋白等多种活性成分，具有很高的营养价值和保健功能，在营养学中被誉为“蛋白之王”，具有易消化、高生物利用率等优点，是公认的优质蛋白补充剂。有实验研究表明，用乳清蛋白肽长期喂养大鼠，能明显增加大鼠的骨密度、骨矿物质含量和骨骼的承载能力，提高骨骼抵抗骨折的能力，说明乳清蛋白具有一定的抗骨质疏松能力。

斑马鱼与哺乳动物骨骼发育机制类似，该模型克服传统哺乳动物骨质疏松模型耗时长、效率差、灵敏度低、用药量大的缺陷，克服原代骨细胞模型条件苛刻，操作复杂，作用环节单一等不足，为活性药物筛选提供简单、高效新方法。

目前我国主要依靠进口乳清蛋白，本研究以泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松为模型，对比研究进口乳清蛋白粉与自提乳清蛋白粗提粉的抗骨质疏松作用，以期为发展国产乳清蛋白产业奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

野生型AB斑马鱼（3dpf，南京一树梨花公司）。

1.1.2 原料与试剂

进口乳清蛋白粉（WPC-8800，美国HILMAR）；乳清粉（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司）；泼尼松龙（源叶生物，批号A1N15J11Q115595）；依替膦酸二钠（源叶生物，批号K22A8M34493）；多聚甲醛（麦克林，批号C10476448）；茜素红S染色液（源叶生物，批号L03D11G133270）；二甲基亚砜（源叶生物，批号Z26D11Y135891）；24孔培养板（美国CorningIncorporat）。

1.1.3 仪器与设备

荧光倒置显微镜（日本Nikon）；FA1204B型精密电子天平（上海精密仪器仪表有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 乳清蛋白粗提粉的制备

乳清粉与超纯水按10∶1的比例溶解，通过卷式膜组件，以PES（聚醚砜）超滤膜材料，选择错流的超滤方式，切向流速选用的最大体积流量4L·min^-1、膜透压为0.25Mpa、温度为25℃为适宜的操作参数，获得乳清蛋白粗提粉样品。

1.2.2 主要药物溶液的配制

1.2.2.1 泼尼松龙溶液

精密称取泼尼松龙22.70mg，用培养基稀释并定容至25mL得2500µmol·L^-1泼尼松龙储备液；取该储备液0.25mL用培养基稀释并定容至25mL，得25µmol·L^-1泼尼松龙溶液。

1.2.2.2含泼尼松龙的依替膦酸二钠溶液

精密称取依替膦酸二钠3.81mg，用培养基稀释并定容至25mL，取该液2.5mL和0.25mL“2.1.1”中泼尼松龙储备液，培养基稀释并定容至25mL，得含泼尼松龙（25µmol·L^-1）的15µg·mL^-1依替膦酸二钠溶液。

1.2.2.3 含泼尼松龙的F-WPC溶液

分别取0.5mL、0.25mL、0.125mL的100µg·mL^-1F-WPC溶液和0.5mL“2.1.1”中泼尼松龙储备液，培养基稀释并定容至50mL，得含25µmol·L^-1泼尼松龙的1µg·mL^-1，0.5µg·mL^-1，0.25µg·mL1F-WPC溶液。

1.2.2.4 含泼尼松龙的Z-WPC溶液

分别取0.5mL、0.25mL、0.125mL的10mg·mL-1Z-WPC溶液和0.5mL2500µmol·L^-1泼尼松龙储备液，用培养基稀释并定容至50mL，得含25µmol·L^-1泼尼松龙的100µg·mL^-1，50µg·mL^-1，25µg·mL^-1的Z-WPC溶液。

1.2.3 斑马鱼给药剂量的选择

选取健康的3dpf的鱼卵均匀地分到24孔板中，每孔5枚鱼卵。将F-WPC溶液、Z-WPC溶液5个浓度1000、100、10、1、0.1µg·mL^-1，分别加入到相应的孔中，每孔1mL溶液，每个浓度设置3个复孔。分别于24，48，72hpf观察胚胎的死亡情况，统计死亡率并绘制累计死亡率曲线。

1.2.4 斑马鱼骨质疏松模型的建立及分组

根据“1.2.3”实验结果，为使幼鱼尽可能存活至9dpf，给药期间选择72h内大于90%存活率的浓度作为最高给药浓度，即1µg·mL^-1F-WPC溶液、100µg·mL^-1Z-WPC溶液，设置高中低3个剂量组。实验分为对照组、模型组、依替膦酸二钠（15µg·mL^-1）组、1µg·mL^-1、0.5µg·mL^-1、0.25µg·mL^-1F-WPC组以及100µg·mL^-1，50µg·mL^-1，25µg·mL^-1的Z-WPC溶液组。将3dpf的斑马鱼幼鱼小心移至24孔板中，每孔5条，3孔为一组。每孔加入相应的溶液1mL，所有组每24h更换一次溶液，直到斑马鱼发育到9dpf。

1.2.5 斑马鱼骨骼的茜素红染色

将9dpf的幼鱼置于MS-222（200mg·L^-1）中麻醉致死后固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液3h，再将斑马鱼幼鱼置于50%乙醇中处理10min；去除乙醇后加入茜素红染色液，放置过夜；第二天去除染色液，加入超纯水洗去多余的染液，再加入新鲜配制的漂白剂（含1%KOH和1.5%H₂O₂），放置2h；去除漂白剂后，逐步以比例为3∶1，1∶1和1∶3的0.5%KOH和甘油的混合溶液各处理6h，最终保存于纯甘油中。采用Imageproplus6.0软件处理荧光倒置显微镜采集放大100倍的显微成像图，计算斑马鱼头骨染色面积和累积光密度（分别代表斑马鱼头骨矿化面积与骨密度）。n=6，计算平均值及标准偏差，并通过t-test比较各组的差异。

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