醇脱氢酶催化合成(S)-哌啶醇及产物抑制机制（三）

2.5 单水相催化体系的探索

据报道，反应体系中添加助溶剂可能影响产物的转化率和立体选择性。由于KpADH还原NBP0的e.e.值为97％，因此通过溶剂的优化可能提高终产物的立体选择性和反应转化率。作者针对单水相体系和水-有机两相体系进行了研究，根据不同底物浓度的研究结果，固定500mmol/L的底物浓度，保持底物与酶添加量的质量比(S/C)为18.2:l的条件下，选择不同的醇类助溶剂、有机溶剂以及绿色离子液体BMIN·PF6进行体系的优化。

如表2所示，反应体系2、3、4中分别加入体积分数5％醇类助溶剂，可以看出助溶剂虽然提高了反应的初速率，但是反应很快就在转化率为60％左右时终止，这是产物抑制导致的。反应5中加入5％的乙酸丁酯，最终转化率达到98.2％。由于乙酸丁酯的疏水性使得产物空间上与酶分离，因而转化率得以提升，但也限制了酶与剩余底物的充分接触，最终使得反应在24h的转化率未达到99％以上。少量有机溶剂的添加对e.e.值没有影响。综上，其中最佳的反应体系为不加任何助溶剂的磷酸盐缓冲液体系，在该体系中，反应转化率可以达到99％以上。

2.6 两相催化体系的探索

采用水-有机溶剂的两相体系可实现底物与酶、产物与酶在空间上的相对分离，从而避免酶失活。底物NBPO是疏水性底物，略微溶于水，不利于与酶分子充分接触。此外，底物对酶分子有一定毒性，这也会导致酶分子的失活，因此尝试两相反应体系实现油-水的界面反应。作者选取了具有不同1gP值的10种有机溶剂进行探究，分别测定了产物和底物在有机溶剂中的分配系数以及有机溶剂对KpADH催化活性的影响，结果见表3-4。最终选择产物分配系数分别为3.6和15.8以及残余活力分别为91％和5％的有机溶剂：甲苯和乙酸丁酯。反应体系6和7表明，50％有机溶剂的加入使e.e.值提高至98.9％。这表明酶在有机溶剂中刚性增强，构象更加稳定。但是，两相反应体系的转化率均没有达到99％的水平，且反应速率较慢，说明大量的底物溶解在有机溶剂中减少了酶与其碰撞的机会,所以反应速率下降，尤其是在反应后期底物较少的情况下，无法与酶充分接触，导致反应不完全。

2.7 克级制备(S)-NBHP

从上述反应体系优化的结果可知，未加入任何助溶剂的反应体系1可在24h内催化还原500mmol/LNBP0，达到99.6％的转化率，见图4。说明在该反应过程中，底物NBP0逐渐溶解并完全转化为产物(S)-NBHP，且产物难溶于水相体系，避免了与酶的大量接触，未对酶活产生显著影响。加入助溶剂后，反应初速度加快，但增加了产物的溶解度，使之达到抑制浓度(459.9±118.6)mmol/L，所以反应快速终止。另外，与两相体系相比，大量有机溶剂的加入可以略微提高产物的e.e.值，但转化不完全会影响终产物的纯度。所以，不加任何助溶剂的磷酸盐缓冲液体系更具备绿色、高效的生物催化制备条件。

因此。在反应体系1的基础上保持底物与酶添加量的质量比(S/C)为18.2g/g不变，逐渐增加底物的质量浓度至200g/L(1m01/L)，最终反应12h，可实现完全转化，产物的e.e.值为97％，产品收率为77％。与来源于酿酒酵母的羰基还原酶YDR541C催化合成(S)-NBHP相比，KpADH能够在不加任何有机溶剂和外源辅酶的条件下实现较高浓度的转化，表明脚ADH在酶法制备(S)-NBHP上具有良好的应用潜力。

3 结语

作者筛选和比较发现勋ADH可以高效还原NBPO合成(S)-NBHP。通过反应体系的探索，发现在加入乙醇等助溶剂的反应体系中有较强的抑制效应，且高浓度的产物NBHP对KpADH催化性能影响显著。通过动力学拟合，发现抑制类型为非竞争性抑制类型，并计算获得抑制常数Ki值为(459.92±118.59)mm01/L。反应体系优化的结果说明，不添加任何助溶剂的体系能够有效地避免产物抑制，同时也能使酶与底物充分接触，反应完全。在此基础上实现了200g/L底物的完全转化，克级制备获得了(S)-NBHP。作者初步探究了NBHP对醇脱氢酶的抑制机制，并优化和建立了解决抑制问题的反应体系，为实现(S)-NBHP的大规模酶法合成奠定了良好的研究基础。

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