高效降解牛奶过敏原蛋白酶菌种筛选及其重组植物过氧化氢酶的功能验证（二）

发布时间：2021-10-11 14:04 编辑者：特邀作者周世红

1.2.4 重组植物过氧化氢酶的构建

以提取的枯草芽孢杆菌S7基因组为模板，根据飞行质谱结果获得的植物过氧化氢酶基因序列设计引物(见表2)，PCR扩增从而获取目的基因片段。随后将载体pET-24a(+)与PCR产物分别与相对应的限制性内切酶混合，在37℃下孵育1.5h，两者酶切产物经过胶回收纯化后用DNA连接酶连接，在16℃下连接6～8h，连接产物通过热激法转化E.coliDH5α感受态细胞，在LB卡那霉素抗性平板上挑取阳性克隆子，菌落PCR验证后提取质粒，经过测序鉴定，最终获得含有目的基因的重组质粒pET-24a(+)/katA。将质粒pET-24a(+)/katA转化E.ColiBL21(DE3)感受态细胞，最终获得重组植物过氧化氢酶表达菌株。

1.2.5 重组蛋白的纯化

纯化过程全部在4℃下进行，将离心收集的重组菌充分倒入培养基。将菌体重悬于25mL缓冲液A(200mmol/LTris-HCl(pH7.4)，500mmol/LNaCl，5mmol/Lβ-mercaptoe-than01)中，使用BransonSonmer450对细胞进行了超声破壁处理，高速离心后收集破碎液上清液。再采用AKTAStart(GEHealthcare)和HisTraD亲和柱对目标蛋白质进行纯化，在经缓冲液A平衡后接入上清液，先使用含5mmol/L咪唑的缓冲液A进行清洗后，使用含300mmol/L咪唑的缓冲液A进行洗脱，获得重组植物过氧化氢酶。

1.2.6 脱脂奶粉水解产物的LC-MS/MS活性多肽鉴定

水解产物经过超滤、脱盐等预处理后，直接加载到反相预柱(AcclaimPepMapRSLC)进行肽段分离，分离后肽段经QExactiveP1us混合四极轨道质谱仪分析，收集的串联质谱结果上传至mascot搜索引擎进行分析，比对后获得对应的肽段序列。

2 结果与分析

2.1 针对底物α_s1酪蛋白高选择性的野生菌筛选与鉴定

将筛选获得的野生菌进行16SrRNA和功能基因gyrA鉴定，以确定各个野生菌的种属，再分别进行发酵培养，获得其发酵液上清液。由于不同野生菌蛋白酶表达量不同，无法直接使用发酵液上清液进行横向比较。而0PA法可检测整个体系水解程度，ELISA可以检测水解反应体系中针对某一特定底物的水解程度，利用此特点设计实验，首先通过0PA法确定各个发酵液的酶活，再分别稀释，使其针对整体底物脱脂奶粉的酶活达到相同水平。此后，将调整浓度后的发酵液对脱脂奶粉进行水解反应，并通过ELISA分析对底物α_s1酪蛋白的酶活。如此可筛选出对混合底物脱脂奶粉的酶活相同时，对过敏原α_s1酪蛋白选择性更高的蛋白酶产生菌。如图2所示，横坐标为各个野生菌的种属名和筛选编号，纵坐标为调整后发酵液上清液的水解叱，酪蛋白酶活。其中酶活最高的为枯草芽孢杆菌S7发酵液上清液，而作为对照的商业酶A-2SD和NY-10酶活较低。在总酶活调整一致的情况下，其他野生菌针对过敏原酶活水平不高，如嗜麦芽寡养单胞菌S2、绿脓假单胞菌S8(非食品安全菌)，故选择枯草芽孢杆菌S7为去除过敏原的主要研究对象，并进行菌种保藏(CCTCCN0.M2016532)。同时被鉴定为枯草芽孢杆菌的还有S21和S23，值得关注的是S21和S23酶活水平接近，但与S7有显著差异。

2.2 关键酶鉴定

通过比对S7和S21的发酵液上清液进行SDS-PAGE分析发现,枯草芽孢杆菌S7在5.5×10⁴位置分泌的一种蛋白质在S21发酵液中分泌量极少。此后使用MALDI-TOF/T0F对各个条带进行肽指纹图谱分析，如图3所示，以3.2×10⁴的鞭毛蛋白(uniProtKB：P02968，含量最高条带)作为对比参照，主要蛋白酶为2.8×10⁴的枯草芽孢杆菌蛋白酶E(UniProtKB：P04189)，而表达量差异最大是5.5×10⁴的植物过氧化氢酶(UniProtKB：P26901)。

2.3 植物过氧化氢酶的重组表达及功能验证

通过从枯草芽孢杆菌S7中调取植物过氧化氢酶基因，并构建重组表达质粒，获得异源表达菌株。再通过诱导表达和镍柱亲和层析法，获得了重组植物过氧化氢酶。如图4中SDS-PAGE所示，泳道1为镍柱纯化流穿峰，泳道2为5mmol/L咪唑洗脱峰，泳道3为300mmol/L咪唑洗脱峰，在5.5×10⁴左右可见明显条带，证明获得可融性表达的重组酶。

通过将纯化后的重组植物过氧化氢酶回补至S21发酵液上清液巾，S21水解α_s1酪蛋白的酶活从75.43U/L提升至106.18U/L达到与S7的119.43U/L相近水平，从而证明了S7和S21的酶活差异主要是由植物过氧化氢酶的表达量差异导致的。据此，我们发现植物过氧化氢酶不仅可以水解过氧化氢，维持更好的还原环境，协助枯草芽孢杆菌蛋白酶E抵抗氧化应激，保护其结构不被自由基破坏，增加蛋白酶作用时间；可能还具有破坏蛋白胶粒中的二硫键，将其中的过敏原α_s1酪蛋白释放出来，使蛋白酶可以更高效地进行水解反应，增强蛋白酶的选择性脱敏效果(见图5)。