高效降解牛奶过敏原蛋白酶菌种筛选及其重组植物过氧化氢酶的功能验证（三）

2.4 植物过氧化氢酶对风昧的影响

采用已报道的高效液相色谱法测定S7和S21发酵液上清液水解脱脂奶粉后水解产物中游离氨基酸的浓度，并比对二者差别。如图6所示，两种枯草芽孢杆菌的发酵液上清液可水解脱脂奶粉生成氨基酸比例相似的水解产物，如均可生成较多亲水氨基酸，如谷氨酸(E)和酪氨酸(Y)，以及较多的疏水氨基酸，如缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和苯丙氨酸(F)。但南于S7发酵液上清液中含有较多的植物过氧化氢酶，可打开二硫键使得更多的水解位点得以暴露，有效增加蛋白酶对酪蛋白胶粒，特别是其中α_s1酪蛋白的水解，同时也就形成了对风味更为有利的水解产物，如相比于S21生成了较多亲水氨基酸赖氨酸(K)，且生成的疏水氨基酸浓度和比例也呈显著下降。

水解产物中的苦涩风味主要来自各类疏水氨基酸，如亮氨酸(L)和苯丙氨酸(F)，而甲硫氨酸(M)则会带来类似肉类、蛋类的不良风味，这对于奶粉的制备是不利影响。为验证其风味，邀请5位品鉴人对微量S7和S21水解5h后的脱脂奶粉水解液进行感官评定实验，并给予0～5分的打分。如表3所示，相比于未处理的脱脂奶粉，两种水解液苦味均有增加，但S7的水解液苦味较低更易被接受。由于植物过氧化氢酶的加入，水解产物中的亲水氨基酸增多且疏水氨基酸减少，这使得水解后的脱敏奶制品具有更易接受的风味及应用价值。

2.5 脱脂奶粉水解产物的功能性多肽鉴定

将枯草芽孢杆菌S7的脱脂奶粉水解产物进行LC-MS/MS活性多肽鉴定，在获得肽段序列后与已报道的文献进行比对。如表4所示，水解产物中含有抗高血压活性多肽5种，以及抗菌活性多肽、矿物质结合活性多肽、血管紧张素转化酶抑制活性多肽、免疫调制活性多肽和抗癌活性多肽各1种，这些肽在天然蛋白质巾并无活性，在被水解释放后才具有活性。他们可以以完整的形式被吸收，在肠道局部发挥各种生理作用，也可以在进入循环系统后产生全身作用。进一步证明植物过氧化氢酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶E混合水解的脱敏奶制品具有更好应用价值。

3 结语

α_s1酪蛋白是奶制品的主要过敏原，人体自身消化系统难以水解，从而导致该过敏原可完整的通过消化系统进入血液从而诱发人体过敏反应。α_s1酪蛋白难以被水解的主要原因在于各种酪蛋白容易通过疏水作用和分子问二硫键相互交联形成酪蛋白胶粒，使得过敏原α_s1酪蛋白被包裹其中，蛋白酶难以接触其水解位点。化学还原剂可有效破坏各类二硫键，但难以应用于食品工业中。相比而言，生物还原剂则具有用量少、可高温灭活去除等优点，如烷基过氧化氢还原酶、硫氧还原蛋白还原酶和二氢硫辛酸脱氢酶等均被报道可有效破坏二硫键，但这些二硫还原酶均为胞内酶难以适应胞外复杂环境：Sri等报道了来自Bacillussp.MTS的一种分泌型二硫还原酶，但其原始菌非食品安全菌。此外，使用其他来源的分泌型二硫还原酶极可能与筛选获得的枯草芽孢杆菌蛋白酶E不适配，导致其被蛋白酶水解而无法发挥作用，故挑选枯草芽孢杆菌植物过氧化氢酶辅助水解。存此前的报道中，此酶已被多次证实可帮助细胞和分泌酶对抗氧化应激，本实验结果表明在其存在的情况下，枯草芽孢杆菌蛋白酶E对于水解α_s1酪蛋白的酶活可增强约1.5倍，从而推测该酶可促进蛋白酶水解富含二硫键的底物。将获得的枯草芽孢杆菌蛋白酶E和枯草芽孢杆菌植物过氧化氢酶混合，应用于脱敏奶制品制备，其产品除了具有低过敏原，还有相对容易接受的口感并含有一定的生物功能性多肽，具有较好的食品工业应用价值。

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