益生乳酸菌筛选及其对草石蚕汁发酵特性的影响（一）

草石蚕又名螺丝菜、甘露子，是一种唇形科水苏属多年生草本植物。原产地是中国，主要分布于云南、四川、贵州、西北和华北等地。草石蚕营养价值丰富，富含蛋白质、多糖、多种矿物质和维生素，口感脆爽鲜嫩且无纤维，是腌制泡菜的上好食材。传统的草石蚕腌制工艺是利用附着在草石蚕菜体上的乳酸菌等微生物，配合糖、醋等辅料进行自然发酵，这种腌制工艺虽然便捷，但是在腌制过程中会产生大量的亚硝酸盐或滋生大量杂菌，导致产品亚硝酸盐含量过高、霉变、腐败，威胁人体健康。

乳酸菌通常被认为是食品级微生物，由于能产生独特的风味和具有抗菌作用而广泛应用于发酵食品中，其中利用乳酸菌制作泡菜类食品最为常见。研究表明，乳酸菌在发酵过程中能有效降解亚硝酸盐，抑制泡菜中杂菌生长；同时，乳酸菌发酵还能产生维生素、多糖等营养成分，提高泡菜产品的营养附加值。吴映明等研究发现人工接种乳酸菌腌制甘蓝泡菜，能有效降低甘蓝泡菜的亚硝酸盐水平。吴海清等采用直投式乳酸菌粉腌制卫青萝卜泡菜能缩短发酵周期。目前，国内外利用乳酸菌发酵草石蚕泡菜的研究鲜有报道。

本研究旨在筛选优质益生乳酸菌，并将其接种至草石蚕菜汁培养基发酵，模拟人工接种乳酸菌发酵草石蚕腌制泡菜。通过分析其发酵草石蚕菜汁时的生长特性、产酸特性、抑菌特性、B族维生素含量等指标，探究乳酸菌对草石蚕泡菜的影响。

1 材料与设备

1.1 菌种来源

本研究所用到的菌株如表1所示。

1.2 主要试剂和药品

亚硝酸钠、亚铁氰化钾、四硼酸钠、乙酸锌、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸购于国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、琼脂粉、氯化钠、硫酸锰、牛肉浸膏、七水硫酸镁、柠檬酸二氢钾、吐温-80、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、无水葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、琼脂粉购于永华化学科技(江苏)有限公司。

1.3 培养基和缓冲液

1)MRS液体培养基

蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、无水葡萄糖20g/L、牛肉膏10g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温801mL/L，121℃灭菌15min。固体培养基在液体培养基的基础上添加2％的琼脂。

2)叶酸测定培养基(FACM)

FACM干粉配置成96.9g，L的溶液，121℃灭菌15min。

3)LB半固培养基

胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉1.2％，调节pH值至7.0，121℃灭菌15min。

4)叶酸缓冲液

磷酸二氢钾0.1mol/L、磷酸氢二钾0.1mol/L、抗坏血酸0.1g/L，调节pH值至6.8，现配现用。

1.4 仪器和设备

pH酸度计(PB-10)、电子天平(PL203)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；涡旋振荡器(SW-2FD)，上海医科大学科学仪器厂；生物安全柜、小型离心机，美国Thermo公司；生化培养箱(SPX-150B-Z型)，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；尤尼柯2000可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；全自动灭菌锅，美国Tuttnauer公司；恒温水浴锅(DK-8D)，上海精宏实验设备有限公司；冷冻干燥机，德国Christ公司；酶标仪(SpectraMax190)，美谷分子仪器(上海)有限公司。

1.5 试验方法

1.5.1 草石蚕菜汁培养基的制备

将新鲜草石蚕洗净后清水浸泡2h，按料液比1:1的比例加水榨汁。菜汁用双层纱布过滤2次后离心20min(4℃，10000r/min)。取上清液加入2％的葡萄糖和2％氯化钠，121℃灭菌15min后备用。

1.5.2 益生乳酸菌的筛选

1.5.2.1 菌株的活化

菌种活化：将-80℃保藏的菌种用划线的方法活化。将乳酸菌、指示菌划线于适宜的固体培养基中培养(见表1)。挑取单菌落于相应液体培养基培养过夜。

1.5.2.2 优势菌的筛选

选自实验室菌种保藏库中的10株乳酸菌经活化后，按3％的接种量接至草石蚕菜汁培养基中，37℃培养24h后用紫外-分光光度计测定菌液0D_600nm值。按0D_600nm值的大小选取生长情况良好的菌株进行后续试验。

1.5.2.3 接种量的确定

定将初筛获得的植物乳杆菌ZJ316、副干酪乳杆菌ZFM54、沙克乳杆菌ZFM225经活化后，按1％，2％，3％，4％，5％的接种量接至草石蚕菜汁培养基，37℃培养24h，利用平板涂布法测定草石蚕菜汁发酵液中的活菌数。

1.5.2.4 菌株生长曲线和产酸量的测定

将植物乳杆菌ZJ316、副干酪乳杆菌ZFM54、沙克乳杆菌ZFM225活化后。按3％的接种量接入草石蚕培养基，每隔4h用紫外-分光光度计测定菌液的OD_600nm值、pH值和可滴定酸浓度。用0.05mol/L的NaOH溶液进行酸碱滴定，并以酚酞溶液为指示剂指示滴定终点，可滴定酸度按式(1)计算：

式中，α一总酸度，％；N_NAOH一NaOH溶液的浓度，mol/L；V_NAOH一NaOH溶液滴定体积，mL；V_样品—样品体积，mL。

1.5.2.5 亚硝酸盐降解试验

将活化的植物干杆菌ZJ316、副干酪乳杆菌ZFM54、沙克乳杆菌ZFM225按3％的接种量接至含1％NaNO2的草石蚕菜汁培养基中，37℃培养48h，每6h取样。参照国标GB5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法绘制标准曲线，并测定亚硝酸盐含量，计算结果用降解率表示。

降解率(％)=[1-(样品亚硝酸盐含量/空白组亚硝酸盐含量)]×100（2）

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