山西老陈醋大曲细菌群落结构及多样性研究（二）

2.2 大曲细菌群落结构分析

将0TU序列在NCBI网站进行BLAST比对分析，采用MEGA5.1软件构建系统发育进化树。从图2和图3结果可以看出：山西老陈醋大曲中共检测到4个细菌门，分别是厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门，其中厚壁菌门和变形菌门为优势菌门，分别占69.67％和29.17％，放线菌门及拟杆菌门仅占0.86％和0.28％。

如图2所示，厚壁菌门上仅检测到杆菌纲，包括的菌属主要是：乳杆菌属、芽孢杆菌属、魏斯氏菌属、片球菌属、高温放线菌属、明串珠菌属和科克罗彭斯特菌属，相对丰度分别为32.82％.29.45％，2.13％，1.65％，1.01％，0.65％和0.09％。

乳酸菌是大曲和食醋酿造过程中的主要优势细菌，其代谢产生的乳酸等不挥发性酸可以降低食醋中醋酸的刺激性气味，改善食醋风味，赋予山西老陈醋绵酸醇柔的特点。另外，乳酸菌除产酸外，还可以产生细菌素等抑菌物质.在整个酿造过程中起到抑制杂菌、净化、保持、改善酿醋微生态环境的作用。乳酸菌产生的γ-氨基丁酸(GABA)是近年来揭示的传统谷物醋中重要功能成分之一。

图2表明山西老陈醋大曲中的乳酸菌菌群主要是乳杆菌属。其中，OTU3与瑞士乳杆菌)B1-3相似度达99％。高亦豹等在江苏白酒大曲中也检测到瑞士乳杆菌。李岩等则从永春老醋发酵过程样品中筛选出具有较高耐酸性的瑞士乳杆菌YCL-5，并将其应用于葡萄醋的静置液态发酵中，用于改善葡萄醋的发酵风味。OTU33与短乳杆菌SKBl023相似度达99％。相似地，刘雄等和吴林寰在酿醋大曲和镇江香醋发酵过程中也检测到短乳杆菌的存在，并推测短乳杆菌可能是食醋重要功能活性成分—川芎嗪的前体乙偶姻的主要产生菌株。OTUl0与耐酸乳杆菌0JC01相似度为99％，此菌种最初是由Entani等在米醋酿造过程中检测到的，该菌能够以葡萄糖、果糖、甘露糖等多种碳源为底物进行发酵，代谢产物主要为醋酸和乳酸。张荣展等采用PCR-DGGE法也证实了耐酸乳杆菌在天津独流老醋酿造中的存在，由于其具有较强的耐酸性，因此是发酵后期的优势菌群。OTUl5与桥乳杆菌HBUAS52247同源性达99％。桥乳杆菌最初是在开菲尔粒中被发现，是典型的异型乳酸发酵菌株，能发酵己糖产生乳酸、乙醇和二氧化碳。姚粟等和高亦豹等分别在芝麻香型白酒大曲和江苏白酒大曲中检测到桥乳杆菌。桥乳杆菌也在发酵酸面团和发酵豆乳清等其它发酵食品中被检测到。

它发酵食品中被检测到。除乳杆菌属外，魏斯氏菌属、片球菌属和明串珠菌属也是乳酸菌的重要菌属。0TU53和0TU2分别与绿色魏斯氏菌FB077和融合魏斯氏菌HBUAS54389相似度最高(100％)。魏斯氏菌属具有很强的产β-葡糖苷酶的能力，能够参与发酵底物中纤维素的降解，另外，具有产乳酸、产胞外多糖、产抑菌物质等特性，近年来在食品发酵工业中开始受到关注。与本文研究结果相似，Nie等利用PCR-DGGE技术在山西老陈醋大曲和酒醪中检测到绿色魏斯氏菌和融合魏斯氏菌。孙峰宇则从食醋酒醅中分离纯化到1株微小魏斯氏菌，并将其与酵母菌进行协同醋酸发酵。最终使醋醅中的乳酸含量提高了2.10倍，柠檬酸含量提高了4.5倍，酯类含量提高了10％，有效改善了液态酿造食醋的风味。OTUll与乳酸片球菌C1-36-L4a相似性达100％。Ln等和叶光斌等在泸州老窖高温大曲和武夷红曲糯米酒发酵液中也检测到了乳酸片球菌。本文还检测到假肠膜明串珠菌的存在。明串珠菌属是典型的异型乳酸发酵菌株，能发酵糖类产生多种酸和醇，还能代谢柠檬酸产生风味成分双乙酰圈。具有抗氧化和拮抗致病菌等能力，常用于发酵乳制品、泡菜和果酒中。刘芸雅等对绍兴黄酒麦曲的研究发现，明串珠菌属在麦曲制备后期逐渐增加。并和乳杆菌属协同分泌乳酸，从而为酵母菌的生长繁殖提供适宜的酸性环境。焦玉双等将假肠膜明串珠菌L18强化应用在老陈醋发酵中，最终使新淋醋中不挥发酸含量得到显著提高。

图2结果显示，OTU97与0TU4分别与解淀粉芽孢杆菌SXKFl6-5和HYM25相似度达到99％，0TU7和0TU23则与地衣芽孢杆菌KW55P和SSl的相似度达99％和100％。研究表明，解淀粉芽孢杆菌为酱香型白酒大曲中的优势细菌，在大曲制备过程中人为接种地衣芽孢杆菌后，显著提升了大曲的淀粉酶活性和酱香型大曲典型风味物质—己酸乙酯的含量。另外，吴林寰采用宏基因测序揭示芽孢杆菌能以己糖为碳源生成乙偶姻，乙偶姻累积到一定程度后与重要中间代谢产物异硫氰酸酯(C₅H₉NS)反应，环化、脱羧、脱硫后可生成食醋重要功能活性成分—川芎嗪，故芽孢杆菌是提升食醋营养功能价值的重要菌种。

高温放线菌具有明显的嗜高温特性，常见于自然界的高温场所，如堆肥、稻草、蔗渣等，具有产细胞溶解酶、嗜热淀粉酶和新普鲁兰的功能，是研究嗜热酶的重要微生物。近年来，一些学者相继从多种类型大曲中发现了高温放线菌的存在。叶光斌等通过构建泸州老窖高温大曲细菌16SrRNA基因克隆文库，检测到普通高温放线菌及高温放线菌。相似地，葛媛媛等圈也从芝麻香型白酒大曲中分离到1株普通高温放线菌，研究证实其具有嗜高温、产碱性磷酸盐酶、酯酶、类酯酶等特性。本文首次在山西老陈醋大曲中检测到高温放线菌，关于其在食醋大曲和酿造中的作用机制及开发利用尚待进一步研究。

0TU28与血液克罗彭斯特菌X0394相似性达100％。姚粟等采用构建16SrDNA克隆文库的方法研究芝麻香型白酒高温大曲的细菌群落，发现克罗彭斯特菌是大曲中的第2优势菌属，其发现的象牙色克罗彭斯特菌属首次报道，目前尚未有关于其功能的研究报导。刘延波等闭利用高通量测序技术在浓香型白酒大曲中也检测到克罗彭斯特茵，并证实此菌种由于不耐高温，在大曲制备后期丰度显著下降。

非厚壁菌门细菌系统发育树如图3所示，变形菌门的γ-变形菌纲，检测到的菌属包括泛菌属和不动杆菌属，分别占27.36％和0.80％。

泛菌属是常见的植物内生菌，具有很强的固氮活性和促生作用，能以木质素为碳源。代谢生成醇类物质，其次级代谢产物具有广谱抗菌活性阿。本文检测到的泛菌属的菌种主要是成团泛菌、彩花泛菌和布氏泛菌，可能来源于制曲的原料大麦或豌豆中。泛菌属产生的抑菌活性物质可能在长达21d的制曲和3～6个月的大曲成熟和储存期间起着抑制杂菌的作用。Li等闭研究发现，泛菌属具有编码β-葡萄糖苷酶的基因，除分解底物中的纤维素类物质外，还参与形成烯萜类化合物，可赋予食醋果香及酯香等风味。另外，成团泛菌还能发酵D-葡萄糖和其它糖类产生有机酸，提升食醋中不挥发性酸的含量。
检测到的不动杆菌主要是约氏不动杆菌和不动杆菌。王晓丹等研究证实不动杆菌属是遵义地区酱香型大曲重要细菌类群之一，可分泌重要的生物活性物质，如抗生素、酶和维生素，还能产生磷脂和叶黄素等功能活性物质。

放线菌门上主要检测到直杆糖多孢菌和霍尔迪糖多孢菌。相似地Nie等和Li等也曾采用DGGE技术在山西老陈醋大曲中检测到直杆糖多孢菌的存在，并证实此类菌属能代谢糖类生成挥发性脂肪酸。

除食醋生产大曲外，白酒大曲中也有发现糖多孢菌属菌群的报道，研究表明其可产生抗肿瘤抗生素、多种酶类、酶抑制剂等多种生物活性物质。

本文首次在食醋大曲中检测到北黄黄杆菌的存在。关于黄杆菌属，是1923年由Bergey首次从海洋沉积物中分离并命名的，目前已包含60多种模式菌株，关于其在大曲中存在的作用和意义，今后需进一步进行研究。

3 结论

本文主要采用高通量测序技术揭示山西老陈醋大曲的细菌群落结构，证明厚壁菌门和变形菌门为优势菌门。芽孢菌属、乳杆菌属和泛菌属为主要的优势菌属，其中与瑞士乳杆菌、短乳杆菌、耐酸乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和成团泛菌等具有很高的相似性。菌群结构的揭示，为解析山西老陈醋微生物酿造机理、强化菌种制曲、大曲制备工艺革新等奠定了基础，对传统山西老陈醋的现代生物技术创新提升。产业转型、升级具有重要意义。

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