微孔多聚糖止血粉成分及体外生物降解分析（一）

发布时间：2021-11-01 20:11 编辑者：特邀作者周世红

在不可控出血中，创伤出血和外科手术失血是日常意外事故中经常发生的事故，出血失控也是导致伤员死亡的重要因素。为了避免大量失血，因此开发出有效、快速并且安全的止血剂在事故现场以及院前及时有效的止血意义重大。近年来，随着生物医学、材料学、生物工程的快速发展，生物止血材料在促进伤口愈合方面显示出巨大潜力。各种类型的止血粉也不断被开发出来，其类型逐渐由动物源向植物源转化，不可吸收向可吸收转化。其中，微孔多聚糖止血粉是一种自主研发的新型高分子材料，主要是由马铃薯植物淀粉经过变性处理后所制成的微孔多聚糖淀粉颗粒，可通过立即吸收血液中的液体成分以及浓缩血小板和凝血因子来实现，具有良好吸附凝血成分的效果，起到加速内源性凝血过程，从而达到快速的术中止血目的。其作为一种来源于植物淀粉的材料，理论上来说是非常安全的，并且在人体伤口处施用后，最终会被组织以及体液中相应的酶分解，形成单糖等机体正常所需成分，最终被机体所代谢出体外。生物相容性和高效止血材料的开发可以被视为术中和术后快速止血的最佳方法。2004年，Murat等首次描述了植物性淀粉来源的止血剂。目前，可吸收止血剂已经成为外科医疗设备的重要组成部分，用于处理术中出血。鉴于这些止血剂能够有效满足外科手术过程的基本需求，新的止血剂不断开发，其安全性也是最为关注的。

止血粉的商业信息表明，它们在外科手术中被用作控制毛细血管、静脉和小动脉出血的辅助止血剂。成功的止血对于最大限度地减少与一般外科手术有关的围手术期发病率和死亡率至关重要。在外科手术过程中，当无法通过常规方法控制出血时，通常使用外科止血剂作为辅助手段，该方法可以实现快速止血的安全性和有效性，易于使用且能够在大伤口中形成持久止血并且对血源性疾病没有任何风险。Giday等研究证实了止血粉末可以在动物动脉出血中的实现初始止血，而且没有肠梗阻或意外的管腔效应，没有局部或局部颗粒效应，没有全身栓塞效应，也没有全身凝血作用。在临床上，这种多聚糖止血粉在内窥镜鼻窦手术、皮肤外科手术和腹腔镜手术中表现了出色的效果。目前国内尚无同类具有自主知识产权的产品面市。因此，本文重点探讨微孔多聚糖止血粉的主要成分以及止血粉生物降解的动态变化规律，以期为临床使用止血粉提供代谢依据。

1 材料与方法

1.1 材料

微孔多聚糖止血粉。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备

止血粉样品在烘箱中50℃烘至恒重后，称量3份，每份称取约5.0mg，分别溶于1mol/L三氟乙酸（TFA）溶液，配成浓度5mg/mL。100℃下降解12h，分别取200μL降解液旋转蒸发去除酸解样品中的TFA，用稀氢氧化钠溶液调pH至中性，加水定容于20mL容量瓶，配成上样浓度50×10^-6，0.22µm滤膜过滤备用。

1.2.2 标准品溶液配制

配制100×10^-6的葡萄糖和麦芽糖标准溶液及其混合标准溶液；配制7个浓度梯度葡萄糖和麦芽糖二者的混合标准溶液，葡萄糖浓度分别为0.1×10^-6、0.5×10^-6、1×10^-6、2×10^-6、4×10^-6、8×10^-6和10×10^-6，麦芽糖浓度分别为1×10^-6、5×10^-6、10×10^-6、20×10^-6、40×10^-6、80×10^-6、100×10^-6；进样量为20μL；采集时间为40min。

1.2.3 止血粉标准曲线

将止血粉配成母液浓度为1mg/mL，沸水溶解，冷却至室温，再将母液倍比稀释成0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL和0.03125mg/mL的溶液，分别取200μL加入至96孔板，然后再分别加入0.1mol/L碘溶液10μL，充分混匀后立即采用全波长酶标仪在610nm处测其吸收度（A值），绘制淀粉标准曲线。

1.2.4 止血粉体外酶解

称取定量止血粉于烘箱中50℃烘至恒重。配制20mmol/LNaH₂PO₄和6.7mmol/LNaCl溶液，用1mol/LNaOH/HCl调节pH为6.9，称量止血粉110.8mg，用上述缓冲液配成止血粉浓度为1mg/mL。加入30.7mgCaCl₂（～2.5mmol/L），于沸水中溶解5min，冷却至室温。分别取出3份各3mL溶液，作为酶降解0h的样品。剩余溶液中加入3mgα-淀粉酶粉末，混匀。把上述已加α-淀粉酶溶液分装于三个相同的50mLEP管中（3个平行样），每管33mL。放入37℃恒温水浴锅中进行降解，分别作用1h、2h、3h、5h、8h、12h、24h、36h、48h后，每个时间点取3mL样品，100℃煮沸除酶活性。其中1mL样品于12000r/min离心15min，取上清液，超纯水稀释10倍至止血粉浓度为100×10-6用于离子色谱分析；其余2mL样品灭酶活后不离心直接用于止血粉淀粉含量测定，每个样品分别取3份200μL转移至96孔板，然后分别加入0.1mol/L碘溶液10μL，充分混匀后立即采用全波长酶标仪在610nm处测其吸收度（A值）。