响应面法优化白芷挥发油提取工艺及其抗氧化活性研究（一）

白芷为伞形科植物白芷Angelicadahurica（Fisch.exHoffm.）Benth.etHook.f.或杭白芷Angelicadahurica（Fisch.exHoffm.）Benth.etHook.f.var.formosana（Boiss.）ShanetYuan的干燥根。白芷中含有香豆素类、挥发油、多糖类、黄酮类等多种有效成分，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效。现代研究表明，其具有抑制黑色素、抗氧化、镇痛、抗炎、抗过敏等药理作用，在临床应用广泛。白芷具有抑制黑色素的作用和抗氧化作用，可作为美白化妆品的原料。由于白芷无毒且香气浓郁，也常作为肉类制作的调味品，可除去牛羊肉的膻味。挥发油作为白芷的有效成分之一，是其作为药品和调味品的重要活性成分。

提取挥发油的一般方法有压榨法、溶剂提取法、水蒸气蒸馏法和超临界CO2萃取法等。考虑到药品和食品的安全性和操作的可行性，在前期研究的基础上，白芷挥发油的提取选用水蒸气蒸馏法，该法操作简便、溶剂安全易得，并采用Box-Behnken设计响应面法优选白芷挥发油的提取工艺，克服了正交试验精度不够的缺点。同时，通过体外抗氧化试验测定白芷挥发油对羟自由基清除率和DPPH自由基清除率，考察其体外抗氧化能力，为白芷产品的综合开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白芷（购于北京同仁堂药店），其产地为四川，经鉴定为白芷为伞形科植物白芷Angelicadahurica（Fisch.exHoffm.）Benth.etHook.f的干燥根。其质量标准均符合《中国药典》（2020版）的各项规定。抗坏血酸标准品（天津市科密欧化学试剂有限公司），DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，AR，合肥巴斯夫生物科技有限公司），无水乙醇，无水硫酸钠，硫酸亚铁，水杨酸，过氧化氢均为分析纯，实验用水为实验室自制蒸馏水。

1.2 仪器与设备

FA20413分析天平（上海精密科学仪器有限公司），WF111710-849万能粉碎机（江阴市万通药化机械设备有限公司），JB挥发油测定仪（常州普天仪器制造有限公司），T6型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

2 方法与结果

2.1 白芷挥发油的含量测定

取干燥后经粉碎成一定粒度的白芷粉末50.0g，置于2000mL的圆底烧瓶中，加入一定量蒸馏水，浸泡一定时间，采用水蒸气蒸馏法提取白芷挥发油，参照2020版《中国药典》（四部2240挥发油测定法）测定挥发油的体积，记录出油量，经无水硫酸钠干燥后，置于具塞瓶中称重。依据公式计算得油率，得油率（%）=（M₁-M₂）/M₀×100％。其中M₁为挥发油和具塞瓶的总质量，M₂为具塞瓶的质量，M₀为药材粉末质量。

2.2 单因素试验

水蒸气蒸馏法提取挥发油的影响因素主要有液料比、浸泡时间、提取时间和粉碎粒度。本实验选取以上4个因素作为单因素试验的考察因素。

液料比A确定：精密称取过50目筛的白芷粉末50.0g，置于2000mL的圆底烧瓶中，浸泡时间为2h、提取时间为3h，考察不同液料比5∶1mL/g、10∶1mL/g、15∶1mL/g、20∶1mL/g、25∶1mL/g对白芷挥发油得率的影响。

浸泡时间B确定：精密称取过50目筛的白芷粉末50.0g，置于2000mL的圆底烧瓶中，液料比为15∶1mL/g，提取时间为3h，考察不同浸泡时间0h、1h、2h、3h、4h对白芷挥发油得率的影响。

提取时间C确定：精密称取过50目筛的白芷粉末50.0g，置于2000mL的圆底烧瓶中，液料比为15∶1mL/g，浸泡时间为2h，考察不同提取时间2h、3h、4h、5h、6h对白芷挥发油得率的影响。

粉碎粒度D确定：精密称取分别过10目、24目、50目、65目、80目筛的白芷粗粉50.0g，置于2000mL的圆底烧瓶中，液料比为15∶1mL/g，浸泡时间为2h，提取时间为3h，考察不同粉碎粒度对白芷挥发油得率的影响。

2.3 Box-Behnken响应面试验设计

在单因素试验的基础上，进一步采用BoxBehnken模型设计试验，以液料比（A）、浸泡时间（B）、提取时间（C）、粉碎粒度（D）四个影响因素为自变量，以白芷挥发油得率为响应值Y，进行响应面分析，确定最佳提取工艺条件

BoxBehnken试验因素与水平见表1。

2.4 抗氧化活性的测定

2.4.1 DPPH自由基清除能力测定

参考马延红等测定挥发油抗氧化活性的方法，并略作改动。取不同量的白芷挥发油至于50mL的容量瓶中。用无水乙醇将样品配制成0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL不同浓度的白芷挥发油样品溶液，分别取2.0mL上述样品溶液和2.0mL浓度为0.1mmol/mL的DPPH溶液置于具塞比色管中，混合均匀后放于避光处静置30min后，用紫外分光光度法在波长517nm处测定其吸光度，重复测定三次，取平均值，记为A1；用相同体积的无水乙醇分别代替DPPH溶液和白芷挥发油样品溶液，在相同条件下测定吸光度，分别记为A2和A0。按照公式计算清除率，并以和样品同浓度的抗坏血酸（Vc）对照品溶液作为阳性对照。清除率（%）=［1-（A1-A2）/A0］×100%。

2.4.2 羟自由基清除能力的测定

参考罗秋水等清除羟自由基的方法，略有改动。取6支试管，依次加入2.0mL的6mmol/LFeSO4溶液，分别加入浓度为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL的白芷挥发油无水乙醇溶液1.0mL和2.0mL的6mmol/LH2O2溶液，充分振摇后，静置10min，再依次加入2.0mL的6mmol/L的水杨酸乙醇溶液，待混合均匀后，在50℃的水浴中反应30min，并置于波长517nm处测得不同浓度下的白芷挥发油溶液吸光度，平行测定三次，取平均值记为Aa，用1.0mL的无水乙醇代替样品溶液测得空白对照液吸光度A0，用1.0mL无水乙醇代替样品溶液不加显色剂H2O2测得底物的吸光度Ab。按公式计算羟自由基清除率，清除率=［1-（Aa-Ab）/A0］×100%。以和样品同浓度的抗坏血酸（Vc）对照品溶液作为阳性对照。

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