细胞水平染料木素协同维生素D3的抗骨质疏松作用（二）

2 结果与分析

2.1 维生素D₃联合染料木素对MG-63细胞增殖和分化的影响

采用MTT法测定药物作用细胞24h后MG-63的细胞存活率。如图1a所示，维生素D₃在1.56～100.00μmol/L浓度对MG-63细胞无毒性，在6.25，12.50，25.00，50.00，100.00μmol/L浓度可明显促进MG-63细胞的增殖（P＜0.05）。如图1b所示，染料木素在1.56～50.00μmol/L浓度对MG-63细胞无毒性。染料木素浓度在3.12，6.25和12.50μmol/L可显著促进MG-63细胞的增殖（P＜0.05）。故选择1.56，3.12，6.25，12.50，25.00，50.00μmol/L浓度进行组合。如图1c所示，低浓度的维生素D₃和染料木素联合用药对MG-63细胞的增殖具有协同作用，且浓度在6.25μmol/L时更为显著。

ALP作为成骨细胞分化的前期标志之一，可随着成骨细胞的生长而表达增加，可以代表骨形成的状态。药物作用48h后测MG-63细胞的ALP活性。如图2a和2b所示，药物浓度在3.12～50.00μmol/L时，与染料木素和维生素D₃单药组相比，联合组可显著增强MG-63细胞中ALP活性。维生素D₃在浓度为3.12μmol/L和6.25μmol/L时抑制了ALP活性，而联合染料木素可使维生素D₃对ALP活性的抑制作用逆转。染料木素浓度在3.12，6.25，12.50μmol/L时可显著增强ALP活性。

交联的蛋白质和胶原蛋白随着成骨细胞生长增殖，可产生羟基磷灰石并堆积在基质中矿化，茜素红可结合形成的钙结节发生颜色变化，产生深红色的化合物。选择浓度为6.25μmol/L的维生素D₃，染料木素及其二者联合用药组进行钙结节的检测。矿化培养21d后，可在倒置显微镜下观察到MG-63细胞中的钙结节，矿化组和试验组形成了更多的不透明结节。如图2c所示，积累的钙结节被茜素红染成深红色化合物，形状不规则，表明有成骨活性。加入10％的西吡氯铵（CPC）溶解结合钙结节的茜素红以定量钙沉积情况，在550nm下测量吸光度值，如图2d所示，表明维生素D₃联合染料木素可形成更多茜素红和钙产生的深红色化合物促进矿化基质的形成。

2.2 染料木素和维生素D₃对MG-63细胞OPG、RANKL表达的影响

药物作用24h后，采用PT-PCR方法通过比较Ct法测定OPG和RANKL在成骨细胞的相对表达量。如图3a和3b所示，与对照组相比，单药染料木素组和维生素D₃组的OPGmRNA表达量均增加；而且与单药组相比，染料木素联合维生素D₃组OPGmRNA表达量显著增加，但增加的作用不是呈剂量依赖性的。如图3c和3d所示，与对照组相比，染料木素和维生素D₃组的MG-63细胞中RANKLmRNA表达均降低。在浓度为6.25～50.00μmol/L范围内，联合组的RANKLmRNA表达比维生素D₃组显著降低，而与染料木素组对比无差异。OPG与RANKL的相对比例破坏可能导致骨吸收增加，微结构改变和骨折风险，在破骨细胞生物学和骨吸收调节中起到关键决定因素和最终步骤的作用，如图3e和3f所示，联合组中OPG/RANKL的比值显著大于维生素D₃和染料木素组，且染料木素、维生素D₃以及维生素D₃与染料木素联合组对OPG/RANKL的比值均随着药物浓度的增大而减小。表明维生素D₃与染料木素联合可能通过OPG/RANKL途径对成骨细胞增殖分化产生协同作用。此外，染料木素对MG-63细胞的增殖和分化作用较维生素D₃显著。

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