聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳在环境微生物中的应用（二）

2 PCR-DGGE在环境微生物学中的应用

2.1 微生物多样性

由于不需要了解单菌特征，PCR-D G G E已被 广泛用于废水生物处理过程中总体细菌种群或者 
具体细菌种群的遗传多样性分析。1993年 ，基于 l 6SrDNA片 段 的 PCR-DGGE首先被应用于微生 物群落和生物膜的群落复杂性分析[2]。Curtis等采 用 PCR-D G G E比较了不同污水处理厂的活性污 泥中总微生物群落的多样性。Gillan等 [l9]采用 PCR-DGGE并结合序列克隆分析了双壳类生物的壳 上生物膜中微生物群落组成。陈红歌等w 采用PCRDGGE研究了垃圾填埋场细菌种群空间分布及组成多 样性。殷峻爭11 应用PCR-DGGE技术研究处理含氨废 气的生物滤塔中微生物多样性及处理时间对生物多样 性的影响。

ward等[22]采 用 PCR-DGGE研究了温泉中微 生物群落的动态变化。刘 新 春 等 [23]采 用 PCRDGGE法解析了活性污泥系统中微生物群落结构 变化，比较了常温条件下运行的2 种不同的活性 污泥系统中微生物群落结构的动态变化。由于工艺相 同，使得接种的低温群落和常温群落在相同的操作 条件下，产生相似的微生物群落结构。滕应等[24]用 PCR-DGGE分析了重金属污染的农田土壤中微生 物多样性及群落动态的变化。电泳图谱表明， PCR产物经DGGE检测后得到的电泳条带清晰且分离 效果好，可明显反映出重金属复合污染导致了农 田土壤微生物在基因上的损伤，影响到农田土壤 生态系统的细菌丰富度，改变了土壤环境的优势 群落，从而使农田土壤微生物群落结构的多样性 发生变化。

2.2微生物群落的动态变化

PCR-DGGE的最大优势之一是可以同时分析 多个样品，是检测环境变化后引起微生物群落变化 
的一个强有力的工具。Donner等跟踪了远洋的 动态变化过程中细菌群落结构和活性的连续变 
化。从不同时间、不同地点的水样提取的细菌总 DNA的 16S rDNA PCR-DGGE条带变化反映纤维 素酶和酯酶的酶活性的变化。Santegoeds等[262结合 微传感器和PCR-DGGE技术监测了生长的细菌 生物膜中群落的变化、硫酸还原菌的开始、缺氧区 的变化。DGGE结果显示:伴随着生物膜的生长，观 察到的DGGE条带数増多，表明细菌种类的増多。 Ferris等口采用DGGE研究了热泉微生物膜中温 度梯度变化时微生物群落的分布变化。DGGE条 带分析表明相同温度的同一位置和不同位置的样 品具有相似的DGGE条带，但是不同温度时具有 不同的条带。

2.3富集和筛选过程中菌株的分析和跟踪

PCR-DGGE除了可以研究微生物群落的复杂 性 ，还可以监测富集培养过程中的微生物。1996 
年,Santegoeds等[282使 用PCR-DGGE监测热泉藻青 群 落 中 好 氧 化 能 有 机 营 养 细 菌 的 富 集 培 养 。 Felske等 采 用 PCR-DGGE跟踪了分离的细菌样 品在丰富培养基上的培养效率等。Teske等/092使用 rDNA片 段 DGGE跟踪混合培养和纯培养过程中 细菌菌株的筛选分离过程，并分离得到 2 个菌株， Desulf Ovibrio 和 Arcobacter Brinkhoff 等米用特定 的 16SrDNA的PCR2DGGE结合微生物学技术从环 境中分离出7 株新的硫酸氧化菌Thiomicrospira，而无 
需通过选择性培养和富集培养来筛选分离。然后， 采用专一性Thiomicrospira探 针 对 PCR2DGGE带 进行基因杂交检测和跟踪目标位置的 Thiomicrospira Jaspers 等使用 PCR-DGGE 结合等 点聚焦的方法分离并跟踪不同细菌。

2.4氨化菌、硝化菌及反硝化菌的分析与跟踪

生物脱氮过程中有氨化细菌（ammoniaoxidizing bacteria ， AOB) 、 亚硝酸菌 (Nit rosomonas) 、硝酸菌(Nitrobacter) 和反硝化菌的参与。这些菌 的种类十分丰富，其群落结构和动态变化会影响微 生物的脱氮效率。其中，A O B菌参与的氧化反应是 硝化反应的限速步骤，A O B在自然环境中数量小、 生长速率慢并且生物量低，因此很难通过传统的纯 培养筛选分离。然而，PCR2DGGE技术可以对自然 环 境 中 A O B 的分类和分布提供更完整的信息。 C!bron等 采 用 PCR-DGGE研究了从巴黎马恩河 (Marne River) 出 口到翁弗勒尔(Honfleur)河口的一 
段长为 365 k m 的富含氨的塞纳河(Seine River) 的 A O B群落。DGGE结果表明A O B主要有两大群 落 ：一类是！ -Proteobacteria 纲中的 Nit rosomonas 和 Nit rosospira;另一类是"-Proteobacteria 纲中的 Nit rosococcus oceani 和 N . halophil us 。不同的 A O B菌属和菌系之间的生理和生态学特征是不同 的。A O B群落分布会受进水特性、时间、空间、盐 度、pH、氨浓度和固体腰浮颗粒等因素影响。来自 于进水中A O B可以保持它们的生物量甚至生长, 
有利于江河中氨污染的解决。Rowan等 W 采用 PCR2DGGE研究了水处理反应器中AOB群落的组成 和多样性。Avrahami等研究了温度对A O B菌种群 结构的直接或间接影响。Bollmann等研究了饥饿 对 AOB 的影响。Silyn-Roberts 等[31]利用 DGGE 在 线分析了生物膜中的硝化菌Nit rosomonas spp。

2.5 硫酸还原菌 & Sulfate.reducing bacteria，SRB)的 分析与跟踪

DGGE被用于跟踪微生物群落中S R B的群落 结构及其随时间、空间的动态变化。Teske等[322采用 PCR-DGGE分析丹麦的玛丽艾厄（Mariager) 海域 的分层河床中S R B的活性和种类，证实了 SR B的 多样性。用 DGGE分析和比较了不同深度的PCR 产物和核酸RT-P C R产物，只有两类活性微生物 菌株存在，并且占的比例很低。米 用 Desulf onema 的专一性寡核苷酸探针对16SrDNA片段的DGGE 条带进行杂交分析，确定了 Desulf onema菌的分 布情况。
Santegoeds 等[33]用 16S rDNA DGGE 研究了来自污水处理厂的生物膜中SR B种群的变化和硫酸 还原的优化。在生物膜的生长过程中，微生物群落 的遗传多样性増多。用专一性寡核苷酸探针对 DGGE条带进行杂交分析，在所有的生物膜和活 性污泥样品中， Desulf obulbus 和 Desulf ovibrio 是 主要的S$ B ，在好氧层内部的厌氧区存在一种隶 属 于 Desulf onema的丝状SRB。但是在第 6 周和 第 8 周可以发现不同种类的 Desulf obulbus和 Desulf ovibrio。

3 发展前景

近 年 来 ，人 们 在 生 物 反 应 器 中 应 用 PCRDGGE技术检测不同Desulf ovibrio群落中[NiFe] 氢化酶的不同表达。> a? e r等：34=首次使用DGGE分 析了 Desulfovibrio菌株中[NiFe]氣化酶基因以及不 同生物膜中Desulf ovibrio菌的系统多样性。通过 对 总 D N A和 m$ N A 的 P C R产物的DGGE条带进 行分析比较，至少发现有两类Desulf ovibrio菌 ，但 是只有其中的一类Desulf ovibrio菌可以优势的表 达[ NiFe ]氢化酶。可利用已发现的功能基因，如氨 单加氧酶(AMO) 基因、亚硫酸还原酶基因等，进行 PCR-DGGE分析微生物群落的功能菌的变化。此 
外 ，D G G E的发展可以促进分析微生物群落复杂 性 的 其 它 基 因 指 纹 技 术 的 发 展 。 比 如 ，16S rRNAPCR -SSCP ( single strand conformation polymor-phism) 技术被用于研究天然细菌群落的 多 样 性 。 ARDRA (amplified ribosomal DNA rest riction analysis) [35]也被用于分析混合微生物群落的 基因多样性。Kowalchuk等[36]证明了 RNA DGGE 分析方法也是一种检测微生物群落变化的快速方 法 ，它可检测分析DNA DGGE技术很难检测到的 活性群落。

尽 管PCR-DGGE存在着一些缺陷，但它具备 的显著优点不仅使得人们对复杂微生态系统的解 
析成为可能，也使得对微生物群落动态变化的研 究成为可能，是一种非常适合分析废水生物处理 过程中微生物群落的多样性及动态变化的基因指 纹技术。这也是PCR-DGGE深受人们关注的最重 要的原因。自Muyzer等[U]开辟了 PCR-DGGE在环境微生物学领域研究的先河以来，该技术迅速引 起微生物生态学家的关注，现已发展成为环境微 生物群落结构分析研究的主要手段之一。在环境 微生物学领域，一个令人兴奋的新方向是利用功 能基因作为分子标记物研究代谢活性。

声明：参考《环境研究与监测》，如涉版权请联系删除

相关链接：微生物，重金属，酯酶