水产养殖中好氧反硝化细菌的筛选及评价研究进展（一）

我国是全球最大的水产养殖国家，养殖水产品总量逐年增长。据统计，2019 年我国养殖水产品总产量达 6 450 万 t，超过世界养殖水产品总量的 70%，为优质蛋白质的供给以及国家的粮食安全做出了巨大贡献。目前，高密度、集约化已成为我国水产养殖的主要模式，然而，养殖密度的不断提高极易打破池塘原有的生态平衡，过多的残饵、粪便无法被池塘中的微生物分解利用，导致氨氮、亚硝酸盐等有害物质积累，影响养殖动物健康。此外，不经处理的养殖废水排放到外环境中产生面源污染，危害养殖业的可持续发展。生物脱氮不仅安全环保，而且具有可续持性，近年来新发现的好氧反硝化细菌因其能够在有氧的条件下进行 反 硝 化 作 用，脱 氮 彻 底，而且具有适应性强、生长速度快及容易控制等潜在优点，逐渐成为脱氮益生菌中研究和应用的热点。

在益生菌研究和应用中，菌种筛选是一个十分重要的环节。然而，由于在菌种筛选过程中候选菌株众多而且筛选条件各异，水产养殖常用的益生菌菌种筛选的方法、标准非常繁杂，导致菌种筛选效率低下; 次，实验室筛选得到的菌种在养殖试验验证过程中，其功能往往不能较好的重现，这主要是由于实验室筛选益生菌的条件或许同其应用的环境有所区别，从而使益生菌应用后在靶位点难以生长、定植及发挥功能; 此外，某些对哺乳动物有益的微生物应用于水生动物可能会产生不利影响。因此，在益生菌菌种筛选过程中制定适合水产养殖的方法、标准就显得非常重要。目前，已有很多关于水产养殖中好氧反硝化菌种筛选应用的研究］，但尚未见到对该菌种筛选及评价方法进行系统综述的报道。因此，本文对水产养殖中好氧反硝化细菌的筛选、评价方法进行归纳、总结，以期对好氧反硝化细菌筛选和评价标准 提 供 参 考，并对未来的研究方向进行了展望。

1 菌种筛选流程

随着研究的深入，已有大量好氧反硝化细菌的研究 报 道，主 要 菌 种 包 括: 假 单 胞 (Pseudomonas sp．)、芽孢杆菌( Bacillus sp．) 、副球菌 Paracoccus sp．) 、海 杆 菌(Marinobacter sp．)、盐 单 胞 菌 ( Halomonas sp．)  和 红 球 菌( hodococcus sp．) 等，然而，尚缺乏对该菌种筛选和评价的系统报道。通过归纳、总结国内外相关文献，好氧反硝化菌种筛选流程和标准如图 1所示。具体而言，好氧反硝化细菌的筛选包括了样品采集、富集培养、安全性评估、菌种鉴定、耐受性评估、功能性评估及应用试验评估等主要组成步骤。通过层层筛选，获得的菌种需要符合安全性、适应性、功能性和便利性等特点.

2 样品处理

理想的益生菌，应该能够在宿主的肠道或环境中定殖、建立和繁殖，然而，某些应用于水产动的益生菌常出现相对无效的情况，这或许是由于非鱼类来源的益生菌无法在其肠道中生存或保持最佳的活菌数。基于此，好氧反硝化菌种分离常采集的样本最好选取池塘的水样、沉积物、微生物絮团及水产动物肠道等样本，从这些样本中筛得的菌种具有更好的适应性，即原位 /宿主益 菌 策 略autochthonousprobiotics/hostassociated probiotic) 。以往研究也发现，在水、泥、沉积物及生物絮团样品中更易筛得好氧反硝化细菌，如滨海芽孢杆菌( Bacillus litoralis) 、枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) 、施氏假单胞菌( Pseudomonas stutzeri)  及 Paracoccus saliphilus 等 菌 种，且具有较好的适应性。此外，采集的样本还可以用高浓度的硝酸盐、亚硝酸盐及铵盐作为唯一氮源进行富集培养，培养过程中需要进行间歇曝气以达到好氧反硝化微生物数量增加，同时确保目的菌种的好氧反硝化性能不退化或可得到进一步加强，通过富集培养可大幅度提高后续菌种的筛选效率。

3 菌种初筛

好氧反硝化菌株初步筛选可应用溴百里酚蓝( bromothymol blue，BTB) 固体培养基，接种的细菌由于反硝化作用使 pH 升高，从而产生蓝色晕圈，选取蓝色菌落即可实现菌种的初筛。应用该方法，从循环水养殖系统的生物滤池中分离到好氧条件下能脱氮的菌株 Z1 和 Z8，Song 等］分离筛选得到高效脱氮的好氧反硝化菌株凝结芽孢杆菌( Bacillus coagulans) XY-6，也筛选 得 到 脱 氮 性 能 较 好 的 好 氧 反 硝 化 菌 种Pseudomonas sp． B5。根据筛选流程，初筛获得的菌种还需要进行安全性评估、菌种鉴定及耐受性评价。

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