褐变黑枸杞对紫外照射损伤果蝇寿命及抗氧化能力的影响

枸杞（wolfberry，RW）是我国重要的药食同源类植物资源。枸杞富含枸杞多糖、β-胡萝卜素等多种活性成分，是珍贵的中药材和滋补保健食品。现代医学研究表明枸杞具有保护视神经、抗衰老、保护细胞、调节免疫力，降血糖和调节血脂等多种药理功效。近年来，枸杞的抗氧化、抗衰老逐渐成为研究热点。

美拉德反应是一种非酶褐变，主要是指羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）间的反应，经过复杂的历程最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精。类黑精是美拉德反应产物中主要的抗氧化成分。有研究表明，美拉德反应中间产物（maillardreactionproducts，MRPs）不仅可改善产品色泽、风味，还具有较强的抗氧化性。

近年来，随着人们对养生保健的重视，枸杞功能性食品的研究和开发越来越深入，特别是枸杞作为抗氧化食品的开发，已成为枸杞加工业研究的热点。美拉德反应与枸杞结合后的褐变黑枸杞（brownblackwolfberry，BBW）抗氧化作用是否优于红枸杞单品，也尚未见报道。基于此，本试验采用美拉德反应原理，首次将枸杞与美拉德反应结合，制备褐变黑枸杞，评价其对紫外损伤果蝇寿命及抗氧化指标的影响，为褐变黑枸杞的抗氧化研究提供理论支持。

一、材料与方法

1、样品

以宁夏枸杞为原料，在75%相对湿度和700C条件下放置6天，再在45⁰C的鼓风烘箱中干燥定型。干燥风速0.5m/s，干燥时间60min即可。得到的褐变黑枸杞在温水中浸泡、打浆、离心、取上清液，浓缩备用。

2、实验动物

野生型Oregon品系黑腹果蝇，由天津科技大学食品添加剂与功能配料研究室提供，置于光暗周期为12h、温度为25⁰C、湿度为65%～75%的恒温恒湿培养箱中培养。

3、仪器与试剂

HWS-850智能恒温恒湿培养箱：宁波海曙赛福实验仪器厂；MR23i冷冻离心机：美国Thermo公司；UVmini-1240紫外/可见分光光度计：日本岛津仪器公司；RE2000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化器厂；紫外灯（20W）。无水葡萄糖、琼脂粉：分析纯，天津江天化工有限公司；对羟基苯甲酸乙酯：分析纯，北京鼎国昌盛生物技术公司，玉米粉、酵母粉：市售；过氧化氢酶（CAT）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（测分型）、考马斯亮蓝试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所。

4、方法

（1）果蝇培养基制备

基础培养基：玉米粉72g，无水葡萄糖72g，琼脂6g，酵母粉10g，40mL防腐剂（1%对羟基苯甲酸乙酯的75%乙醇溶液），750mL蒸馏水。
给药培养基：在基础培养基基础上分别按照终浓度3mg/mL、12mg/mL添加相应剂量的褐变黑枸杞和红枸杞。

（2）寿命实验

收集2d龄雌、雄性果蝇各1200只，平均分为6组，每组200只，其中两组饲喂基础培养基，其中一组不照射紫外线，作为正常对照组（NC），另一组每天照射15min，作为模型对照组（MC），其余四组分别饲喂实验用培养基即加入3mg/mL、12mg/mL的红枸杞和褐变黑枸杞，分别命名为RL、RH、BL、BH，每天照射紫外线15min，每3天更换新培养基并记录死亡数，直至果蝇全部死亡。将自然死亡的果蝇生存天数进行统计学处理，过度麻醉和培养基粘住不计算在内。每组全部果蝇死亡天数的平均数为该组的平均寿命，各组最后20只死亡果蝇的天数平均数为该组的最高寿命，每组中半数果蝇死亡天数的平均数为半数死亡寿命。

（3）果蝇SOD、CAT、MDA含量的测定

收集2d龄雌、雄性果蝇各1200只，随即分为正常对照组、模型对照组、褐变黑枸杞低、高剂量组和红枸杞低、高剂量组，每组200只。收集2d龄雌、雄性果蝇各1200只，平均分为6组，每组200只，其中两组饲喂基础培养基，其中一组不照射紫外线，作为正常对照组（NC），另一组每天照射15min，作为模型对照组（MC），其余四组分别饲喂实验用培养基即加入3mg/mL、12mg/mL的红枸杞和褐变黑枸杞，分别命名为RL、RH、BL、BH，每天照射紫外线15min，每3天更换新培养基并记录死亡数，直至果蝇全部死亡。将自然死亡的果蝇生存天数进行统计学处理，过度麻醉和培养基粘住不计算在内。每组全部果蝇死亡天数的平均数为该组的平均寿命，各组最后20只死亡果蝇的天数平均数为该组的最高寿命，每组中半数果蝇死亡天数的平均数为半数死亡寿命。20d后将果蝇饥饿2h后用工业氮麻醉后称重，记录果蝇质量，按照1：49（mg/mL）加人已灭菌的生理盐水在冰浴条件下匀浆，4⁰C、3500r/min离心10min后取上清液得10%果蝇匀浆液。按照试剂盒说明书分别测定果蝇SOD活性（羟胺法）、CAT活性（可见光法）和MDA含量（TBA法）。

5、统计学分析

数据以平均数土标准差（x±s）表示，数据处理分析，组间差异采用SPSS软件t检验，其中P＜0.05表示差异有显著性，P＜0.01表示差异有极显著性。

二、结果与分析

1、褐变黑枸杞对紫外损伤果蝇寿命的影响

由卫生部颁布的《保健食品功能学评价程序和检验方法》规定，果蝇的生存实验可作为延缓衰老作用的检测方法之一。其评价指标有平均寿命、最高寿命和半数死亡时间。评定标准为一个指标的一个浓度组具有显著性即可判定该保健品具有延缓衰老的作用。

由表1可知，与正常对照组相比，模型对照组的平均寿命、最高寿命和半数死亡时间均显著降低（p＜0.01），说明紫外线照射致果蝇氧化损伤模型造模成功。各剂量组与模型组相比，其平均寿命、最高寿命和半数死亡时间都有所提高。其中，与RL组相比，BH组显著（p＜0.05）延长雌、雄性果蝇平均寿命和半数死亡时间。同时，相比RL组，BH组显著延长（p＜0.05）雌性果蝇的最高寿命。说明在该实验条件下，两种枸杞对紫外损伤果蝇寿命均有延长作用，但是褐变黑枸杞的延寿效果更显著，且呈现一定的剂量——效应关系。

2、褐变黑枸杞对紫外损伤果蝇体内SOD活力的影响

由图1可知，模型对照组的SOD活力显著（p＜0.01）低于正常对照组，说明每天进行15min紫外线照射能够加速果蝇衰老，说明果蝇紫外损伤模型造模成功。与模型组相比，各剂量组SOD活力均有一定程度的提高，但是红枸杞组无显著性差异，BH组呈现显著性差异（p＜0.05）。与RL组相比，BH组SOD活力显著提高（p＜0.05），同时，BH组相较于RH组显著提高（p＜0.05）SOD活力。说明在该实验条件下，褐变黑枸杞能够在果蝇受到紫外线辐射后提高果蝇机体内的SOD活力，对紫外线所造成的氧化损伤有一定的拮抗作用。
 

3、褐变黑枸杞对紫外损伤果蝇体内CAT活力的影响

由图2可知，与正常对照组相比，模型对照组CAT活力显著降低（p＜0.01），说明紫外损伤模型造模成功。与模型对照组相比，各剂量组CAT活力均有所提高，其中BH组显著提高雌、雄果蝇CAT活力。与RL组相比，BH组能显著抑制（p＜0.05）紫外线损伤下CAT活力的降低。

4、褐变黑枸杞对紫外损伤果蝇体内MDA含量的影响

由图3可知，与正常对照组相比，模型对照组MDA含量显著性升高（p＜0.05），说明紫外线照射能够导致果蝇氧化损伤，说明紫外损伤模型造模成功。与模型组相比，各剂量组均有一定程度的降低，其中，BH组能显著降低（p＜0.05）雌、雄性果蝇MDA含量，RH组能显著降低（p＜0.05）雌性果蝇MDA含量。相比较于RL组，BH组能极显著降低（p＜0.01）雌性果蝇MDA含量。表明在该实验条件下，褐变黑枸杞对紫外线所造成的氧化损伤有一定的拮抗作用。

三、讨论

衰老的自由基学说认为，衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。SOD和CAT构成机体主要的抗氧化酶系统，它可清除自由基，减轻和阻断脂质过氧化作用，保护机体免受自由基的损伤。MDA是自由基对不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化作用的最终产物，其含量反映机体脂质过氧化的程度。

本实验结果表明，紫外线照射能对果蝇造成氧化损伤，能显著缩短果蝇的寿命，降低SOD和CAT的活力，提高MDA的含量。褐变黑枸杞对紫外损伤果蝇具有一定的保护作用，尤其是高剂量褐变黑枸杞能显著延长紫外损伤的雌雄果蝇的平均寿命、最高寿命和半数死亡时间，并呈现一定的剂量一效应关系。同时，与红枸杞相比，高剂量褐变黑枸杞能显著提高紫外损伤的雌雄果蝇SOD和CAT活力，降低MDA含量。表明褐变黑枸杞对紫外线照射导致的氧化损伤具有一定的保护作用，作用机理可能是通过提高SOD、CAT的活性，增强机体清除多余自由基的能力，减少自由基引起的生物膜脂质过氧化反应，降低机体MDA的含量，从而起到体内抗氧化的作用。综上所述，褐变黑枸杞可通过清除氧自由基及抗脂质过氧化而延缓衰老，这为今后开发枸杞保健食品提供了科学的理论基础。

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