高效液相色谱-串联质谱法测定仙草及其产品中苯甲酸含量（一）

仙草，又名凉粉草、仙人草，为唇形科凉粉草，属一年生草本植物。在国内主要产于广东、福建、广西、江西、云南等省份。国家卫生和计划委员会在2010年3月发布[2010年]第3号公告，允许仙草作为普通食品生产经营，仙草被列入了中国食同源植物目录。

仙草作为重要的药用和食用植物资源，含有丰富的营养成分，仙草全草干样含有约70％碳水化合物，少量蛋白质、脂肪、色素等，还含有较多的矿物质元素，是一种重要的药食两用的植物资源。在本草中记载仙草的药用功效广泛，具有治疗肾脏病、糖尿病、关节肌肉疼痛、淋病，清暑、解热利水、消渴、降血压，抗衰老、抗癌等功能。是天然、安全、保健、营养食品较理想的原料，其加工利用价值也非常广泛，例如龟苓膏、仙草奶茶/凉茶、食用凉粉果胶等以仙草粉为主料，加多宝等凉茶饮料和其他一些牌子酸奶等饮料配表中也见含有仙草粉，对仙草粉的研究应用已成为热点。产品在东南亚国家及地区很受欢迎。

近两年，国内出口的仙草加工食品中，检出了苯甲酸类物质，在国际经济形势下滑，出口低迷，国外对输入的产品控制越来越严格，有些国家及地区规定不能在该产品中添加苯甲酸类防腐剂，对生产企业的出口贸易造成了较大的影响。苯甲酸和山梨酸是食品工业中常用的防腐剂，能有效防止酵母、霉菌、细菌的生长。我国国家标准GB2760—2014中明确规定了苯甲酸的最大使用限量。

目前，苯甲酸的检测方法有食品安全国家标准GB5009.28—2016，两个标准均为液相色谱法。王海华等、郑玲等、何日安等均研究过液相色谱测定仙草中苯甲酸类物质。由于单纯的色谱法只通过保留时间进行定性，专属性和特异性较差，易产生假阳性或假阴性结果，有文献报道采用色谱质谱联用法检测饮料和调味料中的苯甲酸。尚未发现国内外关于使用高效液相色谱～质谱联用法测定仙草中苯甲酸的文章和报道。本文利用液液萃取法提取仙草中、仙草产品中的苯甲酸，利用高效液相色谱-质谱联用法多重反应监测（MRM），可以对目标物进行准确定性定量，结果满意。

一、实验部分

1、仪器与试剂

高效液相色谱-质谱联用仪LcMs8040，配电喷雾离子源（EsI）（日本岛津公司）；超纯水仪：Sanorius-comfort-I-8-TOc（德国赛多利斯公司）；振荡仪YAMATOSA300（日本YamatoScientificCo，Ltd）。苯甲酸标准品（GBw（E）0822621000μg/mL）（北京坛墨质检科技有限公司）；乙酸铵：GR级（天津大茂）；乙腈：HPLc级（美国默克）；其他试剂为分析纯试剂。

2、仪器条件

（1）色谱条件色谱柱

Shim-packGIST2.0mmI．D×150mmL，2.0μm；流动相A：0.2mmol/L乙酸铵水溶液，B：乙腈，等度洗脱（A/B=70/30）；流速（0.4mL/min）；柱温：40℃。进样量10μL。

（2）质谱条件离子化模式

ESI（一）；离子喷雾电压：4.5kV；雾化气：氮气3.0L/min；干燥气：氮气15L/min；碰撞气：氩气；DL温度：250℃；加热模块温度：400℃；扫描模式：多反应监测（MRM）；驻留时间：20ms；延迟时间：3ms；MRM参数：见表1。

3、标准溶液的配制

标准溶液1000mg/L，用流动相稀释得到0.00、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg/L浓度点。

4、样品前处理

称取样品1～29，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入1.0mL盐酸溶液（1∶1）酸化，加入氯化钠1g，分别用20mL、10mL乙醚提取两次，每次振摇10min，将上层乙醚提取液吸出放另一离心管中，合并两次乙醚提取液。提取液过无水硫酸钠（马辐炉450℃烧4h），用5mL乙醚淋洗，收集乙醚，40℃氮气水浴吹干，加入1mL流动相蜗旋溶解，过0.22um滤膜备用。

5、样品的测定

按Shim-packGIST2.0mmI．D×150mmL，2.0μm；流动相A：0.2mmol/L乙酸铵水溶液，B：乙腈，等度洗脱（A/B=70/30）；流速（0.4mL/min）；柱温：40℃。进样量10μL对标准系列溶液及提取净化样品进行测试，外标法定量。

二、结果与讨论

1、色谱条件的选择

采用液相色串联谱质谱法检测苯甲酸，实验室参考国标GB/T23495—2009方法，分离的色谱柱选用C18进行分析（2.1μm，2.1×150mm）。离子化模式：ESl（一），选择水-乙腈作为流动相，实验室发现，苯甲酸出现峰展宽及拖尾现象，这是由于苯甲酸带有与弱极性基团，而C18色谱柱带有硅羟基结构，而硅羟基与苯甲酸上的羟基发生弱离子交换作用，导致峰展宽。Horiyama等通过在流动相中加人缓冲盐来改善分离效果。王祖翔等通过在流动相中加人0.2mmol/L乙酸铵可以明显改善分离效果，本实验室参照该条件，配置0.2mm01/L乙酸铵和乙腈作为流动相，由于分析单物质，本研究使用等度洗脱，配制浓度为1mg/L点，流动相比例（0.2mmol/L乙酸铵/乙腈（v/v））：（90/10）、（85/15）、（80，20）、（70/30）的比例进行洗脱，从峰形、响应、保留时间分析，（70/30）配比可以达到较好的结果，不同流动相配比对峰型的影响见图1～4。
 

2、质谱条件的优化

配制苯甲酸浓度为1mg/L，在Q3scan扫描模式下，同时进行正离子模式和负离子模式采集，试验结果表明：负离子模式获得较强的准分子离子信号，干扰相对较少。这与苯甲酸分子结构有关，苯甲酸有羧酸结构，易电离生成羧基，从而在负模式下更容易得到较强的准分子离子，因此实验室选择了负离子模式。通过直接进样标准溶液，质谱自动优化得到苯甲酸：定量离子对为121.0/77.0。

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