多重耐药铜绿假单胞菌的整合子检测及分析

目的：探讨多重耐药铜绿假单胞菌的整合因子检测方法及对抗生素的耐药情况。方法：对我院2010年1月至2013年8月临床送检标本中分离筛选出的50株多重耐药铜绿假单胞菌进行了回顾性分析，采用K-B纸片法检测50株铜绿假单胞菌对环丙沙星、头孢噻肟、庆大霉素和亚胺培南等耐药情况；用煮沸法提取50株铜绿假单胞菌的DNA模板；同时应用PCR技术检测Ⅰ类整合子，通过测序分析其所携带的耐药基因。结果：本组研究中，50株多重铜绿假单胞菌对以下4种药物产生的耐药率分别为环丙沙星(18%)、头孢噻肟(32%)、亚胺培南(36%)和庆大霉素(46%)，提示铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性有统计学意义(P<0.05)；其50株铜绿假单胞菌中Ⅰ类整合子检出为9株，检测阳性率为18%。Ⅰ类整合子阳性菌株多重耐药率为85.2%，Ⅰ类整合子阴性菌株多重耐药率为19.8%，阳性菌株多重耐药率明显高于阴性菌株，P＜0.05。结论：整合子是形成铜绿假单胞菌多重耐药的重要因素，临床要充分重视整合因子介导的细菌多重耐药基因水平，从而可降低患者的感染率。

铜绿假单胞菌(PA)是临床上较常见的病原菌，这种细菌可引起院内感染。而整合子是一种细菌基因捕获和表达的遗传单位，是细菌基因中可移动遗传物质，携带位点特异性重组系统组分，并可将许多耐药基因盒整合在一起，从而形成多重耐药。特别是Ⅰ类整合子可携带多种耐药基因，这对人类的健康造成了严重威胁。为探讨并分析多重耐药铜绿假单胞菌的整合因子检测方法和耐药性，将我院临床送检标本中分离筛选出的50株多重耐药铜绿假单胞菌进行了分析研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源及鉴定本研究选定我院2010年1月-2013年8月临床送检标本中所分离筛选出的50株多重耐药铜绿假单胞菌为研究对象，这些铜绿假单胞菌均为我院临床送检的痰液、尿液、胆汁及胸腹水等标本中检验分离出来的。病菌均采用（法国生物梅里埃公司）制造生产的ATB-Expression鉴定仪进行鉴定。

1.2试剂与仪器本实验中使用的环丙沙星和头孢噻肟购自（北京天坛药物生物技术开发公司）；庆大霉素和MH培养基干粉购自（杭州天和微生物试剂有限公司）；亚胺培南（编号：CTO455B）购自（英国OXOID公司）；营养琼脂购自原卫生部（上海生物制品研究所）；PCR试剂购自（中山大学达安）试剂；仪器购自（上海宏石公司）。

1.3方法①药物敏感试验：K-B纸片法参照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)操作规程进行；②DNA模板制备：取0.5mL无菌管加入50μL蒸馏水，挑取少量新鲜细菌，50℃煮沸10min，8000r/min离心10min，取上清液备用；③整合子可变区扩增：以煮沸法提取细菌总DNA作为PCR模板，PCR反应体系为10×PCR Buffer(含Mg2＋15mmol/L)2.5μL，dNTPs2μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，两条引物各0.5μL，模板DNA为1μL，加无菌水补足至25μL☆。反应条件：93℃2min，93℃30s，55℃30s，72℃60s,30个循环；72℃60s。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察结果，并用凝胶成像系统照相并保存结果。PCR产物片段送（上海生工生物工程有限公司）测序，测序结果与GeneBank中已知序列比对。

1.4统计学方法所有数据均采用SPSS10.0统计软件进行分析处理，计量资料采用t检验，计数资料采用检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本研究结果显示，50株多重耐药铜绿假单胞菌对以下4种药物的耐药率分别为环丙沙星(18%)、头孢噻肟(32%)、亚胺培南(36%)和庆大霉素(46%)，提示铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性具有统计学意义(P<0.05)。其50株铜绿假单胞菌中Ⅰ类整合子检出为9株，Ⅰ类整合子检测阳性率为18%。Ⅰ类整合子阳性菌株多重耐药率为85.2%，Ⅰ类整合子阴性菌株多重耐药率为19.8%，阳性菌株多重耐药率明显高于阴性菌株，有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

有资料表明，临床上铜绿假单胞菌耐药机制十分复杂，诱因也比较多，且这种病菌的耐药性在不同的地区之间，乃至同地区、不同医院之间引起铜绿假单胞菌耐药的机制也不尽相同。目前随着我国临床抗菌药物的广泛使用，铜绿假单胞菌耐药性基因的种类和数量也发生了很大的变化，并呈现严重之趋势，尤其是临床上出现的多重耐药菌株，不仅为患者的治疗造成了很大影响，同时也给医院感染控制带来了较大困难。因此我们临床医生及时了解铜绿假单胞菌耐药基因与耐药机制，这对临床上合理用药具有重要意义。

我们知道，整合子是与细菌耐药性传播相关的基因系统，是存在于细菌质粒、染色体或转座子上的一种遗传结构，可捕获耐药基因，使细菌表现为对抗生素的多重耐药。虽然整合子相对分子质量较小，但它能够通过整合酶从环境中捕获耐药基因盒，并将耐药基因盒组装在一起，形成巨大的耐药基因多基因座，同时在基因转移和多重耐药的形成中起主导作用，耐药基因水平的高低能导致细菌在临床上产生一定的耐药性，且能够加速细菌的传播速率，若一旦新形成的耐药基因被整合子捕获，极有可能在细菌间广泛播散，并且形成对新抗生素的普遍抗性，这会给临床治疗带来很大困难。有资料显示，Ⅰ类整合子在铜绿假单胞菌中分布广泛，在耐药性产生的机制上起着重要作用，是导致细菌多重耐药的关键。但我们从本研究的结果可以看出，分离出的50株铜绿假单胞菌对环丙沙星、头孢噻肟、亚胺培南和庆大霉素等4种药物有较高的耐药率，其耐药率分别18%、32%、36%和46%；而Ⅰ类整合子检测阳性率为18%，整合子阳性菌株比阴性菌株多重耐药率更高（P<0.05），证实了整合子介导了多重耐药的产生。

综上所述，本研究对多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株携带的I类整合子检测与相关耐药性进行了分析，以进一步研究整合子在细菌耐药中的作用。我们临床医护人员思想上应有足够的认识，严格掌握本地区铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性，并加大监测力度，在临床上要正确合理使用抗生素，以防止耐药菌株的播散，从而减少医院感染率的发生。

声明：本文所用图片、文字来源《中国抗生素杂志》2020年第1期，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

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