酶辅助超声提取阿尔泰金莲花总黄酮工艺研究（一）

阿尔泰金莲花（Trolliusaltaicus），为毛茛科金莲花属多年生草本植物，主要生长于我国新疆阿勒泰、塔城地区，性苦寒，具有清热解毒、消炎杀菌、止血止咳等功效，其干燥花蕾临床上多用于呼吸道感染、急慢性咽炎和扁桃体炎等病症的治疗，当地民间也将其泡水饮用以预防感冒等疾病。然而，作为商品金莲花的来源药材之一，该药材的研究报道较少。荭草素半乳糖苷等黄酮碳苷类化合物是该药材发挥药效的主要活性成分，并进一步探讨了其总黄酮的回流提取工艺。超声辅助提取是利用超声波的强烈的振动、空化、搅拌等效应破坏植物细胞壁，促进有效成分溶于提取溶剂中。酶辅助超声提取法结合了酶法和超声提取法的优点，不仅提取时间短、提取效率高，且能较好地保持提取物的特性和品质，现已被广泛应用于中草药活性成分的提取之中。本文拟通过考察酶制剂的种类、酶添加量、pH、料液比、提取时间、提取温度以及提取功率对其所含黄酮提取率的影响，进一步结合Box-Behnken实验设计和响应面分析，优化阿尔泰金莲花总黄酮的最佳酶辅助超声提取工艺，为阿尔泰金莲花及其总黄酮的深度开发提供参考数据。

一、材料与方法

1、材料与试剂

阿尔泰金莲花药材于2016年8月采集于新疆阿勒泰地区，经新疆药物研究所何江副研究员鉴定为阿尔泰金莲花T.altaicus的干燥花蕾，药材粉碎，过40目筛。荭草素2-O-β-L-半乳糖苷对照品（OGA，上海源叶生物科技有限公司，质量分数98.0%，P31O7F23952）；纤维素酶:（4x10⁵U/g）、半纤维素酶（1x10⁵U/g）果胶酶（3x10⁵U/g）和中性蛋白酶（5x10⁵U/g）分别购自上海如吉生物科技发展有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

2、仪器与设备

AS系列超声波清洗机：天津欧特赛恩斯仪器有限公司；DZKW-S-4电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；AL204型分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司，751型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。

3、实验方法

（1）对照品溶液的配制及标准曲线绘制

精密称取干燥至恒重的OGA对照品5.0mg于25mL容量瓶中，用70%乙醇溶解、稀释至刻度，摇匀、静置，得0.20mg/mL的0GA对照品溶液，保存备用。分别精密吸取对照品溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL分别置于25mL容量瓶中，各加水至8.0mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀，放置6min后，加10%硝酸铝溶液1.0mL，混匀放置6min后；再加4%氢氧化钠试液10.0mL，加水至刻度，摇匀放置15min，以相应试剂为空白，在500nm处测定吸光度（A），以A为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=0.523X-0.0109，R₂=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL范围内有良好的线性关系关系。

（2）样品溶液制备及其总黄酮测定

称取一定量阿尔泰金莲花，再分别向其中添加不同体积不同浓度的乙醇，加入酶，在一定温度下分别超声处理一定时间，制得供试样品溶液。精密称取干燥至恒重的OGA对照品5.0mg于25mL容量瓶中，用70%乙醇溶解、稀释至刻度，摇匀、静置，得0.20mg/mL的0GA对照品溶液，保存备用。分别精密吸取对照品溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL分别置于25mL容量瓶中，各加水至8.0mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀，放置6min后，加10%硝酸铝溶液1.0mL，混匀放置6min后；再加4%氢氧化钠试液10.0mL，加水至刻度，摇匀放置15min，以相应试剂为空白，在500nm处测定吸光度（A），以A为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=0.523X-0.0109，R₂=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL范围内有良好的线性关系关系。并计算提取率。阿尔泰金莲花总黄酮提取率Y（%）=（C×V/M）x100%，式中：C为提取液中黄酮浓度（mg/mL），V为提取液体积（mL），M为药材质量（mg）。

（3）酶制剂的选择

称取1.0g阿尔泰金莲花若干份，分别向其中加入占药材质量1.0%的纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、中性蛋白酶，将一份未加任何酶制剂的样品作对照组。每份样品分别加50倍量50%乙醇，加入盐酸缓冲液，调pH分别设定3、4、5、6，将上述各组样品于40℃，超声功率90W下超声提取30min酶解后，各组样品经灭酶（沸水浴5min），过滤得到上清液。分别从各组中取适量提取液，计算金莲花总黄酮提取率。

（4）单因素试验

称取药材1.0g，分别对超声酶辅助提取工艺中的影响因素（酶添加量、料液比、提取温度、提取时间、超声功率）进行考察。酶添加量:0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；料液比：1:10、1:20、1:30、1:40、1:50；乙醇浓度：30%、40%、50%、60%、70%；提取温度：35℃、40℃、45℃、50℃、55℃；提取时间：10min、20min、30min、40min、50min；超声功率：90W、132W、174W、216W、258W、300W。

（5）响应面试验设计

根据Box-Behnken中心组合原理，在单因素试验结果的基础上，选择酶添加量、乙醇浓度、提取时间和提取温度四个因素为自变量，每一自变量的试验分别以-1、0、1编码，以总黄酮提取率（%）为响应值，进行四因素三水平实验，利用Design-Expert8.05软件对试验多元线性回归和二项式拟合，并对拟合方程进行方差分析。因素水平设计见表1。

二、结果与分析

1、酶制剂的筛选

不同酶制剂在不同pH条件下，所得总黄酮提取率也不相同。随着pH的增加，在各种酶制剂作用下，阿尔泰金莲花总黄酮提取率均呈现先增加后降低的趋势。从图1可以看出，纤维酶在pH等于4时作用最好，其提取率可以达到17.09%，大于中性蛋白酶、半纤维素酶、果胶酶、无酶作用下的提取率。原液的pH为6.5，因此从提取率考虑，改变溶液的pH为4，且选择纤维素酶进行下一步试验。

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