基于血清药物化学的不同产地三棱药材 入血成分的含量测定（二）

2.2.6方法学考察

2.2.6.1线性回归方程和线性范围

空白血清稀释混合对照品溶液(各标准品浓度均为0.25g/L)，药物浓度为0.25、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005g/L，取上述系列混合对照品血清溶液，按照标准处理后进行HPLC检测并记录色谱图和峰面积。以横坐标(X)代表血清中药物的质量浓度，纵坐标(Y)代表药物与内标的峰面积比值，计算4种成分的回归方程和相关系数。

2.2.6.2日间精密度和日内精密度试验

大鼠空白血清18份各100μL，不同质量浓度的对照品溶液加入后在线性范围内配成低(0.0005g/L)、中(0.005g/L)、高(0.25g/L)3种待测液各6份，按照标准处理后进行HPLC检测并记录色谱图和峰面积。每天3个剂量各测定6次，记录峰面积，计算日内精密度;1周内连续检测6d，计算日间精密度。

2.2.6.3方法回收率试验

分别配制6份低、中、高浓度的血清样本，按照标准处理后进行HPLC检测并记录色谱图和峰面积，对照品峰面积与内标物峰面积的比值计算后测定质量浓度。将各成分理论的加入浓度和测定质量浓度进行比较，计算方法回收率。

2.2.6.4基质效应试验

分别配制6份低、中、高质量浓度的血清样本，按照标准处理后进行HPLC检测并记录色谱图和峰面积;同时配制相同浓度的以流动相为基质的对照品溶液直接进样分析，空白血清加对照品的测定值与对照品溶液测定值之比即为基质效应，考察血浆基质干扰情况。

2.2.6.5稳定性试验

分别配制18份低、中、高质量浓度的血清样本，取3种质量浓度样品各6份，在室温下放置4h，按照“2.2.4”项下方法处理得到待测血清样本，每个质量浓度的血清样本处理完成后进行HPLC检测;取三种质量浓度的样本各6份，－20℃条件下将含药血浆样本冷冻24h，室温下再溶解，反复冻融3次后进行HPLC检测;另将于－80℃条件将3种质量浓度的样本各5份放置1周，待室温溶解后进行HPLC检测。计算3种条件下的标准偏差(ＲSD)，考察稳定性。

2.2.7统计学处理

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差(x±s)表示，不同组间两两比较采用单因素方差分析(One－wayANOVA)中的LSD法(最小显著性法)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.2.8结果与分析

2.2.8.1专属性试验

结果如图1所示，按照标准处理的大鼠空白血清进行HPLC检测后，空白血清中的香草酸、对羟基苯甲酸、芦丁及阿魏酸对照品及内标物与内源性物质的分离度良好，且没有干扰物质，各药品及代谢物与内源性物质之间没有相互作用，显示该方法专属性良好。

2.2.8.2线性回归方程和线性范围

血清中对羟基苯甲酸的回归方程为Y=56971.00X+282.99(Ｒ2=0.9998)，在质量浓度0.0005～0.25g/L范围内线性关系良好;香草酸的回归方程为Y=36756.00X+247.66(Ｒ2=0.9997)，在质量浓度0.0005～0.25g/L范围内线性关系良好;阿魏酸的回归方程为Y=50686.00X+89.41(Ｒ2=0.9998)，在质量浓度0.0005～0.25g/L范围内线性关系良好;芦丁的回归方程为Y=36349.00X+20.99(Ｒ2=0.9997)，在质量浓度0.0005～0.25g/L范围内线性关系良好。按信噪比(S/N)为3来计算，对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁的最低检测限均为是0.0001g/L。

2.2.8.3回收率、精密度、稳定性和基质效应结果

计算得到各组含药血浆样本的方法回收率＞90%，精密度ＲSD＜10%，各组样品稳定性均ＲSD＜10%，基质效应考察结果在89.53%～95.12%;结果显示实验精密度良好，稳定性及回收率均符合药动学的要求。

2.2.9基于血清药物化学研究不同产地三棱的血中成分测定

根据HPLC条件，对中药三棱干预后的大鼠血浆样品进行测定。以给药时间为横坐标，以相对峰面积为纵坐标，计算各成分的含量，结果显示在连续给予大鼠中药三棱7d后，于末次给药1h后，三棱的药效物质对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁达到峰值。具体结果见表2。

3讨论

通过对三个不同产地三棱药材中的化学成分分析及入血成分研究，进行色谱比较，确定原型成分及代谢产物为对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁。同时可见不同产地三棱药材四种成分体外和入血含量各不相同。药材提取物中对羟基苯甲酸、阿魏酸、香草酸以浙江产地较高，芦丁以江苏产地略高;入血成分中芦丁、对羟基苯甲酸以安徽产地较高，阿魏酸、香草酸以江苏产地略高。所有成分均在1h左右达到峰值。

由于各地栽培的土壤、气候等差异，药材提取物中有效成分含量不同，而吸收入血的成分含量也有所不同。入血成分直接决定药效，所以给药后取含药血清进行分析，分析鉴定血清中移行成分，研究其药效相关性，对确定中药的药效物质基础尤为关键，可为建立合理的中药质量控制模式和方法提供参考。本研究可为三棱的资源综合利用和质量控制提供实验依据。

声明：本文所用图片、文字来源《中国中医药科技》2020年7月第27卷第4期，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

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