基于血清药物化学的不同产地三棱药材 入血成分的含量测定（一）

目的:比较不同产地的三棱饮片入血成分对香草酸、羟基苯甲酸、芦丁及阿魏酸含量的影响。方法:采用高效液相色谱法，对3个不同产地的三棱药材4种有效成分及其在血清中的含量进行考察。结果:由于各地栽培的土壤、气候等差异，不同产地三棱药材4种成分体外和入血含量各不相同;药材提取物中对羟基苯甲酸、芦丁以安徽产地较高，香草酸以江苏产地略高;入血成分中对羟基苯甲酸、芦丁以安徽产地较高，阿魏酸、香草酸以江苏产地略高，所有成分均在1 h左右达到峰值。结论:入血成分含量测定对三棱药材的产地鉴别具有一定的可行性，本研究可为三棱的资源综合利用和质量控制提供实验依据。

三棱指的是黑三棱科植物黑三棱的干燥块茎，其分布范围主要包括长江中下游流域，浙江、江苏、安徽等地。三棱味辛、苦，归脾经、肝经，性平，具有消积止痛以及破血行气等功效，主要用于癥瘕痞块，痛经，瘀血经闭，胸痹心痛，食积胀痛等。其主要成分为挥发油类、黄酮类、皂苷类、生物碱类、苯丙素类及有机酸类等。三棱具有扩血管、抗血栓形成、抗血小板聚集、镇痛等作用。此外，三棱对人肺癌细胞及人乳腺癌细胞具有明确的细胞毒理作用，对肝癌细胞株具有明显的抑制作用。

本研究旨在对浙江、江苏、安徽三个产地三棱药材中的化学成分以及血中移行成分含量进行比较分析，为三棱的资源综合利用和质量控制提供实验依据。

1实验材料

1.1药材

三棱药材购自浙江中医药大学中药饮片厂，浙江(批号:20171016)、江苏(批号:20170925)、安徽(批号:20170812)，与2015版《中国药典》一部的规定相符合。

1.2实验动物

SD大鼠，SPF级，40只，♂，体质量(280±20)g，浙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可证SCXK(沪)2013－0016。大鼠饲养环境:湿度40%～60%，温度25～27℃，食物充足，照明适度，饮水自由。

1.3实验试剂

对照品及内标物均由中国食品药品检定研究院提供，阿魏酸对照品(纯度:≥98%、批号:110773－20161)、对羟基苯甲酸对照品(纯度:≥99%、批号:MKBK3576V)、芦丁对照品(纯度:≥98%、批号:Y23M7N11586)、香草酸对照品(纯度:98%、批号:110776－20150)、内标物核黄素(批号:JS0925ＲA14)。

1.4实验仪器

Agilent1200型高效液相色谱仪器:美国Agilnent;Agilnent Eclipse XDB－C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm);QL－861涡旋混合仪:海门市其林贝尔仪器制造;XS205DU精密天平:METTLEＲTOLEDO公司;2－16PK离心机:德国Sigma公司;ND100－1氮气吹扫仪:杭州瑞诚仪器有限公司;SK5210HP超声波清洗仪:上海科导超声仪器有限公司。

2实验方法

2.1不同产地三棱药材中化学成分分析

2.1.1溶液的配制

2.1.1.1对照品溶液的配制

精密称取适量的对香草酸对照品、羟基苯甲酸对照品、芦丁、阿魏酸对照品，溶解于比例为1:1的甲醇水溶液，混标储备液的对照品浓度为1 g/L，配好备用。

2.1.1.2供试品溶液的配制

分别收集浙江、江苏、安徽三个产地的三棱炮制品，取适量样品粉末及适量甲醇加热回流，放冷，甲醇补足失重，过膜即可。

2.1.2色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse XDB－C18(250 mm×4.6 mm，5μm);0.1%磷酸水溶液作为流动相A，甲醇为B，采用梯度程序进行洗脱:0～5 min，20%B，5～20 min，20～48%B，20～40 min，48～90%B，40～50 min，90%B，50～51 min，90～20%B，51～60 min，20%B。254 nm的检测波长;1.00 mL/min的流速;柱温保持30℃;进样量均为10μL。

2.1.3方法学考察

2.1.3.1线性关系考察

将精密称取的对照品溶液(0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、6.25 mL)分别置于25 mL的容量瓶中，加50%甲醇至刻度，分别用移液器精密吸取10μL进行HPLC检测。按流动相色谱条件分析，测定各自峰面积，以横坐标(X)代表质量浓度，纵坐标(Y)代表峰面积，利用XY值绘制标准曲线。对羟基苯甲酸的回归方程为Y=3.0722X－5.5952(Ｒ2=0.9997)，在质量浓度12.5～400 mg/L范围内线性关系良好;香草酸的回归方程为Y=2.6874X－5.9319(Ｒ2=0.9991)，在质量浓度7.5～250 mg/L范围内线性关系良好;阿魏酸的回归方程为Y=3.0578X－3.7665(Ｒ2=0.9995)，在质量浓度7.5～240 mg/L范围内线性关系良好;芦丁的回归方程为Y=3.4586X－4.8854(Ｒ2=0.9998)，在质量浓度12.5～400 mg/L范围内线性关系良好。

2.1.3.2精密度试验

按照色谱条件，取10μL同一对照品溶液进样检测，连续进样6次，以对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁峰面积计算。结果ＲSD为0.24%、0.35%、1.05%、0.64%(n=6)，仪器精密度表现良好。

2.1.3.3稳定性试验

取三棱样品溶液10μL，按照HPLC色谱条件，分别于2、4、8、12、16、24 h进行上样检测并记录峰面积。对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁峰ＲSD分别为2.76%、2.48%、1.89%、1.68%(n=6)，结果显示该样品溶液在24 h的稳定性良好。

2.1.3.4重复性试验

精密称取6份三棱样品，每份2 g，供试品溶液按照标准制备后进行HPLC检测，记录峰面积。结果对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁峰的ＲSD分别为1.68%、1.54%、2.45%、2.14%(n=6)。

2.1.3.5加样回收率试验

采用加样回收法，精密称取已知含量的三棱样品9份，加入对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁标准品，供试品溶液按照标准制备后进行HPLC检测，计算回收率，对羟基苯甲酸的平均回收率为98.42%，ＲSD为1.79%(n=9);香草酸的平均回收率为97.35%，ＲSD为0.85%(n=9);阿魏酸平均回收率为99.12%，ＲSD为1.59%(n=9);芦丁平均回收率为100.56%，ＲSD为1.89%(n=9)。

2.1.4不同产地三棱药材含量测定

取3个产地的三棱样品，按照标准制成供试品溶液。分别吸取供试品溶液10μL，进行HPLC检测，根据相应线性关系计算样品中对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁含量，结果见表1。

2.2不同产地三棱入血成分研究

2.2.1不同产地三棱药材提取

采用传统煎煮法，取3个产地三棱中药制成含生药2 g/mL的三棱水煎液原液。

2.2.2含药血清制备

取SD大鼠40只，♂，体质量(280±20)g，饲养1周。随机分4组，每组10只，空白对照组、浙江组、江苏组、安徽组。每组分别给予相应的不同产地的三棱药材提取液，空白对照组每天给予等量饮用水，每日固定时间灌胃。大鼠的常规给药剂量按照(药液浓度2 g生药/mL，剂量2 mL/100 g)计算，灌胃1次/d，连续灌胃7 d。最后一次给药前禁食12 h，末次给药结束后，分别于0.5、1、1.5、2、4 h进行大鼠眼眶静脉丛取血，3 000 r/m离心10 min，收集上层血清，56℃灭活30 min，取出后无菌过滤，放入－20℃冰箱保存。每组做混标，混合成2管血清组。

2.2.3对照品及内标的配制

精密称取对香草酸对照品、羟基苯甲酸对照品、芦丁及阿魏酸对照品适量，溶解于甲醇水溶液(1∶1)，混标储备液的对照品浓度为1 g/L，充分混匀，超声30 min，用0.22μm微孔滤膜进行过滤，保存在4℃，检测前稀释成不同浓度。精密称取内标物核黄素适量，溶解于甲醇水溶液(1∶1)，配制内标物浓度为1 g/L的储备液，涡旋充分混匀，超声30 min，用0.22μm微孔滤膜进行过滤，保存在4℃。

2.2.4样本处理

300μL甲醇和100μL内标溶液加到200μL血清样本中，利用涡旋仪进行震荡10 s，此时的溶液为乳白色悬浊液，12 000 r/min、4℃下离心12 min，蛋白质为底部白色沉淀。全部上清用移液枪吸出至离心管后进行氮吹，100μL甲醇水溶液(1∶1)复溶残渣，涡旋混匀，常温下12 000r/min离心10 min，取上清用于测定。

2.2.5色谱条件同2.1.2色谱条件。

声明：本文所用图片、文字来源《中国中医药科技》2020年7月第27卷第4期，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：羟基苯甲酸，三棱，阿魏酸，芦丁