大豆多肽营养干预对预防和治疗尾吊模拟失重大鼠肌肉萎缩的作用（一）

废用性肌肉萎缩是骨骼肌长期不受负荷引起形态、结构、功能发生改变的一种机体变化，可由禁食、卧床、肢体制动、失神经、失重等原因导致，同时也是心血管病、糖尿病等多种疾病的常见并发症。根据2016全球疾病负担报告所述，肌肉相关疾病是影响健康寿命损失年(YLD)的重要因素之一，近十年全球患肌肉相关疾病的人数比九十年代翻了一倍，且年龄标准化率增加60.7％。这一疾病不仅影响患者生活质量，严重时可带来生命危险，也为国家财政带来沉重负担。因此寻找合适有效的治疗肌肉萎缩的方法或进行早期预防，对临床医学、运动医学和航天医学等领域具有重要的科学意义及社会意义。

废用性肌肉萎缩主要表现为肌肉质量和强度的降低、肌纤维变细或消失。大量研究表明，肌肉质量的多少是由蛋白质合成与蛋白质分解动态平衡决定的。当分解速率超过合成速率、蛋白质净生成量减少时，发生肌肉萎缩。蛋白质代谢信号通路的核心物质是Akt(蛋白激酶B，PKB)。控制蛋白质合成的重要途径是由IGF-1介导的IGF-1／P13K／Akt／mTOR，可激活下游信号4EBPl和S6K1转导，调节蛋白质的翻译作用，促进蛋白质合成。控制蛋白质分解的两条重要途径有泛素蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径，其中肌肉萎缩相关基因和萎缩基因均由Akt的下游Fox03控制。当它具有活性时，可从细胞质自由进入核中，与MAFbx／Atrogin-l和MuRFl基因的多个启动子相互作用，增加这两种泛素连接酶E3的表达，促进由二者催化的泛素蛋白酶体途径的进行，或通过影响溶酶体白噬途径，加速蛋白质分解。此外，肌肉萎缩的发生也会伴随氧化应激的出现。此时，机体内抗氧化物酶如SOD、GSH-Px浓度降低，ROS大量增多至超过机体处理能力，直接或间接导致蛋白质损伤，使细胞、组织或器官受损。

目前，除运动及功能训练外，治疗肌肉萎缩的方法主要有药物干预和营养干预。药物包括激素类(如生长激素、胰岛素样生长因子、中药类、丹参、黄芪、抗氧化剂类(维生素E)等。但由于可能具有的潜在副作用，还需大量毒理实验证实，因此营养干预方法受到越来越多的人们广泛的关注。这些营养干预方法普遍从增加蛋白质合成、减少蛋白质分解或改善氧化应激等方面缓解肌肉萎缩症状。Beasley、夏志等研究表明，摄入富含亮氨酸等支链氨基酸的优质蛋白如乳清蛋白，可改善骨骼肌丢失的状况并可减轻体内引发的炎症反应。Bueno等发现，给予病人包含益生元的营养组合物，可增加HMB内源性产生，进而增加mTOR浓度从而促进蛋白质合成。Murata等发现摄入花翠素可通过抑制MuRF-1表达起到预防肌肉萎缩的作用。Valcarce等研究发现，给予小分子PPAR-δ可通过增加肌纤维的线粒体密度增强有氧能力，治疗肌肉萎缩。

大豆多肽是大豆蛋白酶解成的小分子产物，必需氨基酸齐全且平衡，同时较大豆蛋白更易消化吸收，因而具有广阔的应用前景。目前关于大豆多肽对机体的功能性研究主要集中在抗氧化。治疗烧伤、降血压、调节血糖等方面，对蛋白质合成和分解的作用鲜有报道。因此，本文通过建立大鼠尾吊模型模拟失重，对大豆多肽对蛋白质代谢和氧化应激的影响进行深入探讨，以期为营养干预预防和治疗肌肉萎缩的方法提供一定参考。

一、材料与方法

1、材料与仪器

SPF级8周龄Wistar雄性大鼠(动物许可证号：SCXK(京)2016—0006，体质量260～280g)北京维通利华实验动物技术有限公司；大鼠维持饲料斯贝福(北京)生物技术有限公司；大豆多肽(蛋白含量90％)诺利如一(安阳)生物科技有限公司；IGF-1ELISA检测试剂盒、Fox03ELISA检测试剂盒、SODELISA检测试剂盒北京方程生物科技有限公司；普通RIPA裂解液(组织／细胞)北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量分析试剂盒、ECL免疫印迹底物赛默飞世尔科技(中国)有限公司；兔抗MAFbx／Fbx32／Atrogin-1单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔lgG艾博抗(上海)贸易有限公司。

玻璃匀浆器。北京半夏科技发展有限公司；AllegraX一30R离心机美国贝克曼库尔特有限公司；InfiniteM200Pro多功能酶标仪帝肯(上海)贸易有限公司；PowerPac通用电泳仪、Trans—BlotTurbo全能型蛋白转印系统、ChemiDocMP全能型凝胶成像分析系统伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

2、实验方法

（1）动物分组及灌胃设计

将35只大鼠分笼饲养，每天昼夜循环光照12h，环境温度20～25℃，相对湿度50％～60％。自由进食进水，每天更换饲料和饮水。适应性喂养1周后，随机选取15只用于验证大豆多肽预防作用实验，设为地面一对照组1(C1)、尾吊一对照组(M)、尾吊一肽组(T)，每组5只，灌胃40d；剩余20只用于验证大豆多肽治疗作用实验，其中随机选取5只作为地面一对照组(C2)，15只进行尾吊。饲养40d后，将15只尾吊大鼠放回地面，分为尾吊后一高剂量肽治疗组(HT)、尾吊后一中剂量肽治疗组(MT)、尾吊后一低剂量肽治疗组(LT)，每组5只，与C2共同灌胃60d。参照Morey—HoltonE等的方法进行尾部悬吊，使大鼠后肢离地30ο、前肢可自由活动，随大鼠生长及时调节尾吊高度。按照人体每天额外补充5g大豆多肽进行换算得到大鼠每天补充量并以此作为治疗中剂量，即0.45g／(kg·BW·d)，治疗高剂量和低剂量分别设为0.75g／(kg·BW·d)和0.15g／(kg·BW·d)。预防剂量设为0.30g／(kg·BW·d)。所有大鼠均按照0.50mL／(kg·BW-d)进行灌胃，对照组灌胃蒸馏水。

（2）血清和肌肉样品采集

预防实验中，于5、10、17、25、32、40d称量大鼠体质量并记录。治疗实验中，每周第4d和第7d称量大鼠体质量并记录，并于7、21、35d进行尾静脉取血。预防实验灌胃40d时，对C1、M、T组进行解剖。治疗实验灌胃60d时，对C2、HT、MT、LT组大鼠进行解剖。解剖前禁食不禁水12h。解剖时，麻醉后采用腹主动脉法取血。将血液室温静置1～2h，于4℃放置一夜。次日4℃、3000r·min^-1离心10min，取上层血清，-80℃保存备用。取大鼠左侧后肢腓肠肌和比目鱼肌，分别称量腓肠肌和比目鱼肌湿重并计算腓肠肌和比目鱼肌湿重／体质量比：腓肠肌或比目鱼肌湿重／体质量比(mg／g)=腓肠肌或比目鱼肌湿重／72鼠体质量，于-80℃冻藏备用。

(3)血清相关指标测定

采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验检测大鼠血清中IGF-1、Fox03、SOD浓度。向包被对应待测物捕获抗体的微孔中依次加入标准品／样品、HRP标记的检测抗体，37℃温育1h，洗涤未结合的抗原抗体。加入底物TMB于37℃避光孵育30min进行显色，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品中对应待测物浓度。

（4）总蛋白提取及蛋白定量

取0.1g肌肉组织剪碎，加入lmLRIPA裂解液(PMSF浓度为1mmol／L)，在冰水浴条件下用玻璃匀浆器研磨10min，冰上裂解30min。于4℃、12000r·min“离心10min，收集上清即提取的总蛋白，制得肌肉匀浆样品，于-80℃保存备用。采用BCA法对各个样品进行蛋白定量，BSA蛋白标准曲线为：Y=0.6892x+0.0100，决定系数R2=0.9991。最终将样品统一稀释成同一蛋白浓度。

(5)WesternBlot分析

将样品于100℃煮沸5min使蛋白充分变性，采用12％的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，浓缩胶浓度为5％。初始电压为80V，20min后将电压调至120V，约1h停止。将胶上蛋白转移至PVDF膜，5％BSA中(溶于TBST)于37℃封闭2h，在1：1000稀释的一抗中于4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5Bin。加入HRP标记的二抗于37℃孵育2h，TBST洗膜3次，每次5min。加入ECL化学发光底物对条带进行染色，避光结合2min，在凝胶成像仪中对目的蛋白Atrogin-1和内参蛋白GAPDH进行显影，利用ImageLab软件对图像进行分析。实验重复3次。

3、数据处理

采用SPSS软件中单因素方差分析(One-wayANOVA)的Turkey多重比较对数据进行分析。结果以“x±s”表示，P＜0.05或P＜0.01时判断组间差异具有统计学意义。

声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：十二烷基硫酸钠，丙烯酰胺，蛋白酶