高效液相色谱-串联质谱法同时测定葡萄酒中甜味剂、防腐剂和色素（二）

2、色谱和质谱条件的优化
（1）流动相的选择
反相色谱的流动相通常由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈）等组成，由于某些被测物极性较强，流动相的洗脱能力不宜过强，同时待分离的16种添加剂有些极性相近，保留时间相近，采用乙腈为有机相时导致几个组分“共流出”情况较甲醇严重，而甲醇可使16种添加剂的保留时间相对延迟，同时甲醇可以提高离子化程度，峰面积比用乙腈为流动相时大，故选择甲醇为实验的有机相；又由于流动相要进入质谱仪，添加一定量的缓冲溶液可以增加响应值，所以考虑甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸铵溶液、甲醇-乙酸水溶液3种流动相体系。

以被测物在色谱柱上的分离度、峰形、灵敏度等为考察指标对3种流动相体系进行了比较。结果表明，体系中添加了乙酸铵不仅更有利于分离物质在色谱柱上的保留，而且能够提高色素类物质的电离化程度，增加信号响应，从各物质分离度、峰形、响应值以及保留时间的稳定性等指标进行综合衡量，甲醇-10mmol/L乙酸铵作为流动相时，优于其余两种流动相，故实验选用甲醇-10mmol/L乙酸铵为流动相进行梯度洗脱。
（2）柱温的选择
柱温能够影响色谱柱的柱效、选择性、灵敏度和稳定性，柱温的改变直接影响分离效果及分离速率。升高柱温，色谱柱内离子交换速率随之升高，有利于提高柱效、缩短分析时间。本实验考察了柱温分别为30℃、35℃、40℃时，16种添加剂保留时间及响应值的差别，发现当柱温为30℃时，16种添加剂有13种出峰时间均集中在3～4min，分离度差；提高柱温至35℃时，柱效提高，分离度和灵敏度均有改善，继续提高柱温，分离情况无明显变化。考虑到色谱柱在相对较低温度下使用寿命较长，本实验设定柱温为35℃。优化条件下16种添加剂的MRM质谱图见图1。

（3）质谱条件的选择
为获得最佳的灵敏度和分离效果，根据16种添加剂的分子结构特征，在正、负两种电离模式下优化被测物的母离子和特征子离子以及相应的质谱参数。取质量浓度为1mg/L的16种化合物单标准溶液依次采用不接色谱柱直接进样方式进行质谱全扫描检测，得到目标分析物一级质谱图，再用氩气轰击该母离子，得到其二级质谱图，利用仪器的自动优化功能，分别对Q1、Q3、CE等进行优化，确定16种添加剂的母离子和子离子的最佳质谱条件，以强度较大的子离子作为定量离子，强度稍小的子离子为定性离子。
3、方法学评价
（1）方法的线性范围和检出限
将含16种被测物的混合标准储备液添加至稀释5倍的空白葡萄酒样品中，分别配制系列混合标准工作液。

色谱柱：AcquityUPLCHSST₃柱（100mm×2.1mm,1.8µm，美国Waters公司）。流动相：（A）甲醇和（B）10mmol/L乙酸铵水溶液，流速0.35mL/min；梯度洗脱程序为：0min，甲醇的体积分数为10%；0～3min，甲醇的体积分数从10%升至90%，并保持2.5min，5.5～5.51min；甲醇的体积分数从90%降至10%；5.51min～6.5min，甲醇的体积分数保持10%。柱温为35℃；进样体积：2μL。

分析仪器：LCMS-8050；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正负离子同时扫描；离子源接口电压：0.5kV；雾化气：氮气3.0L/min；干燥气：氮气10L/min；碰撞气：氩气；DL温度：250℃；加热模块温度：400℃；扫描模式：多反应监测(MRM)；驻留时间：15ms；延迟时间：3ms；以各组分定量离子色谱峰面积对相应的质量浓度绘制各被测物的标准工作曲线，结果表明，线性关系良好，相关系数（r²）都在0.995以上。

用葡萄酒样品低加标水平计算各组分的检出限和定量限，用信噪比为3确定方法的检出限（LOD），用信噪比为10确定方法的定量限（LOQ），各组分在葡萄酒样品中的检出限范围在0.2～2μg/L之间。结果见表2。

（2）精密度和回收率
用微量移液器向空白葡萄酒样品中准确加入一定量的16种待测物混合标准溶液，配成低、中、高3个浓度水平进行回收率实验。分别准确称取16种添加剂标准品于10mL棕色容量瓶中，用水或甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为1mg/mL的单标储备液，于-18℃下避光保存。用甲醇稀释并配制中间浓度的标准工作液，于4℃避光保存。

根据需要用流动相逐级稀释，配制成适当浓度的混合标准工作液，现配现用。取葡萄酒样品2.0mL于10mL容量瓶中，用超纯水定容，超声混匀，过0.22μm滤膜，滤液供测定。

色谱柱：AcquityUPLCHSST3柱（100mm×2.1mm,1.8µm，美国Waters公司）。

流动相：（A）甲醇和（B）10mmol/L乙酸铵水溶液，流速0.35mL/min；梯度洗脱程序为：0min，甲醇的体积分数为10%；0～3min，甲醇的体积分数从10%升至90%，并保持2.5min，5.5～5.51min；甲醇的体积分数从90%降至10%；5.51min～6.5min，甲醇的体积分数保持10%。

柱温为35℃；进样体积：2μL。

分析仪器：LCMS-8050；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正负离子同时扫描；离子源接口电压：0.5kV；雾化气：氮气3.0L/min；干燥气：氮气10L/min；碰撞气：氩气；DL温度：250℃；加热模块温度：400℃；扫描模式：多反应监测(MRM)；驻留时间：15ms；延迟时间：3ms。

进行6次重复实验，计算其回收率及相对标准偏差（RSD）。结果表明，各目标物平均回收率在89.1%～106.4%之间，相对标准偏差小于9.7%，方法的准确度和精密度均符合多残留分析的要求。
4、实际样品的测定
按所建立的方法对采购的10批次葡萄酒样品进行了16种添加剂的筛查，每个样品重复测定3次。所检葡萄酒样品中有1个检出糖精钠和甜蜜素，含量分别为26.3μg/L、38.9μg/L，其余样品的检测结果均为阴性。阳性样品的MRM质谱图见图2。

三、结论
本研究建立了高效液相色谱-串联质谱仪同时测定葡萄酒中甜味剂、防腐剂和色素含量的方法，前处理简单、分析速度快、准确度和灵敏度高。实际样品的检测表明，该方法能够满足葡萄酒甜味剂、防腐剂和色素残留的分析要求，与国标方法相比，大大提高了分析效率和降低了分析成本，能够满足葡萄酒中痕量分析要求，非常适合大批量葡萄酒样品中16种添加剂的定性和定量分析。

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