基于碘化钾-淀粉显色光度法测定过氧化氢酶活性（二）

5、显色反应时间影响

取50ml容量瓶一只，加入CAT样液(酶活性小于2U／mL)1.00mE、H202基质液2.00mL，25℃水浴反应30min后立即加入1.5mL硫酸终止反应，加碘化钾5mL，60℃水浴加热40min，冷却，加淀粉3mL，定容，以蒸馏水作参比液，在波长600nm处测吸光度A，同时完成酶空白试验吸光度A₀测定，根据△A(△A=A₀一A)确定过氧化氢酶活性E。其它条件不变，只改变反应时间，测定5～70min内A值(图3)。30min内吸光度与时间有线性关系。由此可见，H₂O₂氧化KI具有零级反应的特点，反应物起始浓度直接决定了反应速度，40min后反应完全。所以显色反应时间确定为40min。

6、酶促反应时间影响

取过氧化氢酶工作液10.00mL作测试液，其它条件不变，改变酶促反应时间，测定△Ao以时间t为横坐标，△A为纵坐标作酶促反应曲线。由图4可知：在反应初始阶段的0～30min内，In△A与时间成正比，符合酶促催化一级反应特征。30min后，△A趋于恒定。因此，确定酶促反应时间为30min。

7、工作曲线

取过氧化氢酶标准溶液0.00—20.00mL作测试液，在最佳条件下完成△A测定，绘制工作曲线(图5)。过氧化氢酶活力E(U／mL)在0.002～0.04U／mL范围内与△A呈良好的线性关系：△A=0.06843+16.9866E(U／mL)，r=0.9970。按实验方法平行测定空白10次，标准偏差s为0.01，检测限为0.0018U／mL，最低检出量达到0.15U。

8、干扰试验

取10.00mL过氧化氢酶标准溶液作测试液，按照试验方法考察生物组织共存还原性物质干扰情况。结果发现，2倍于基底液浓度的葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖不影响酶活度测定，测量误差小于5％。

9、样品分析

H₂O₂是动物肝脏细胞代谢中间产物，因而肝脏中具有较多的CAT，实验选取鱼肝脏CAT提取液做分析。将新购活鱼杀死，剥离肝脏，用滤纸吸干，称重，按1:10(w／V)加入1～4℃冷0.25mol／L蔗糖液，匀浆，1500r／min下离心5min，取上清液，用0.25mol／L蔗糖稀释50倍，制得酶粗液，1～4℃环境中保存。取酶粗液1.00mL完成活性测定，平行六次，计算平均值和相对标准偏差，计算回收率。

回收率控制在96％～105％范围内，说明粗酶液共存物质不影响酶活性测定；根据测定结果可推算出鱼肝CAT含量分别为550U／g(鲤鱼)和537U／g(草鱼)。

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