蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖条件的优化（一）

秋葵俗名羊角豆、补肾果等，有蔬菜王之称。秋葵原产于非洲，但现在以推广到东南亚、中东、南美等地区种植。秋葵富含蛋白质、多糖、黄酮类化合物等，具有极高的营养食用价值和经济价值。秋葵含有的多糖成分具有降脂、降压、抗癌、抗热应激性等生理活性，有增强体质和抗疲劳等保健作用，因此受到研究人员的额外关注。

目前，秋葵多糖的测定方法主要有化学法和色谱法，其中化学法主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。其中蒽酮-硫酸法是测定多糖成分常用的一种化学方法，其测定原理是利用浓硫酸对样品中的多糖成分水解、脱水，再与蒽酮结合成有色化合物，利用分光光度计于最大吸收波长处测吸光度。此方法相比较于色谱法具有操作简单、设备要求低、测定快速、测定成本低的优点，但该方法稳定性需要控制好测定条件，如蒽酮试剂现用现配、注意避光，同时还需注意针对不同样品多糖成分的测定其最优测定条件的选择。所以本文探讨利用蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖，不同测定条件对测定结果的影响，通过优化试验确定最优检测条件，从而确定蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖含量的检测条件，为秋葵多糖的开发利用提供检测依据。

一、材料与方法

1、材料与仪器

秋葵粉：豪州市保华药业有限公司；蒽酮（分析纯）：上海国药试剂集团；葡萄糖（分析纯）：莱阳化工实验厂；722可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；FA2004N电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司。

2、试验方法

（1）秋葵多糖的提取和精制

称取5g秋葵粉加入325mL蒸馏水，在90℃水浴中提取3h，过滤后，减压浓缩至100mL。按照浓缩液∶氯仿∶正丁醇为20∶4∶1的比例进行混合除去蛋白（Savage法），转移上清液于烧杯中，加入乙醇使乙醇浓度达80%，静置过夜后，过滤收集沉淀物。利用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤沉淀物，在室温下干燥至恒重，得精制秋葵多糖备用。称取上述精制秋葵多糖5mg，用蒸馏水复溶，移至50mL容量瓶中，配置成0.1mg·mL-1的精制秋葵多糖溶液。

（2）蒽酮-硫酸溶液的配制

精密称量一定质量的蒽酮，以硫酸为溶剂配制成试验中需要的浓度，摇匀后备用，现用现配。

（3）葡萄糖标准品溶液的配制

首先葡萄糖干燥至恒重，再称取0.1000g干燥至恒重的葡萄糖，以蒸馏水为溶剂，定容于100mL容量瓶中，得1.0mg/mL的葡萄糖标准溶液。

（4）最大吸收波长的确定

准确量取秋葵多糖溶液2mL于25mL的具塞试管中，加入3.0g·L^-1蒽酮-硫酸溶液10mL，摇匀后立即放入沸水浴中加热10min，取出后迅速在流动的水中冲洗，使其冷却至室温后，在480～550nm波长范围内进行测定。

（5）蒽酮-硫酸法测定条件的单因素和优化试验设计

以吸光度为评价指标，分别考察蒽酮浓度、硫酸浓度、蒽酮溶液添加量、显色时间四个因素对测定结果的影响。并在单因素试验的基础上确定优化试验因素，选用正交试验设计对测定条件进行优化，从而确定蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖的检测条件。

（6）标准曲线的制作

分别准确移取0.0、1.0、2.5、5.0、7.5、10mL的葡萄糖标准溶液于50mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀后得浓度分别为0.00、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20mg·mL^-1葡萄糖标准系列使用溶液。准确移取上述标准系列溶液2mL于25mL的具塞试管中，在优化后的测定条件下测定，并绘制标准曲线。

（7）秋葵测定样品液的制备

精密称取秋葵粉1.0g，加入100mL蒸馏水，混匀后，在90℃水浴中提取3h，过滤后，减压浓缩至50mL。利用Savage法除去蛋白，上清液转移至100mL容量瓶中，定容得待测液。

（8）精密度试验

精密吸取2mL秋葵待测液和2mL蒸馏水于2支25mL具塞试管中，在优化后的测定条件下测定，样品测定平行6次。

（9）换算因子的测定

取0.1mg·mL^-1精制秋葵多糖溶液2mL，按照优化测定条件进行测定，标准曲线法计算获得以葡萄糖表示的秋葵多糖浓度。按下式计算换算因子：

式中：C1—精制多糖溶液中多糖的浓度，单位为mg·mL^-1；

C2—优化方法测得的以葡萄糖表示的秋葵多糖浓度，单位为mg·mL^-1。

（10）秋葵多糖含量的计算秋葵多糖含量的计算公式如下：

式中：C—样品中含有的葡萄糖质量浓度，单位mg·mL^-1；

D—秋葵样品溶液的稀释倍数；

f—换算因子；

m—秋葵粉样品的质量，单位mg。

二、结果与分析

1、测定波长的确定

利用分光光度计在480～550nm波长的范围内，每间隔10nm测定秋葵多糖溶液的吸光度，结果见图1。如图可知，利用蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖测定液在490nm处有最大吸收峰，因此确定490nm为测定波长。

2、蒽酮法测定秋葵多糖的单因素试验结果

（1）蒽酮浓度对测定结果的影响
 

移取2.0mL样品于25mL具塞试管中，分别加入浓度为2.0、2.5、3.0、3.5和4.0g·L^-1的蒽酮溶液10mL，混匀后于沸水浴加热10min，取出后迅速在流水中冲洗，冷却至室温，于490nm波长下测定吸光度值，测定结果见图2。由图可知，随着蒽酮浓度的升高，吸光度值逐渐升高，在蒽酮浓度达到3.0g·L^-1时，吸光度为0.721，达到最高值；继续增加蒽酮浓度，吸光度变化较小，因此确定蒽酮浓度为3.0g·L^-1时，蒽酮和多糖的反应完全。

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