蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖条件的优化（二）

（2）蒽酮溶液添加量的选择

分别吸取2.0mL样品于25mL具塞试管中，分别加入浓度为3.0g·^L-1的蒽酮溶液各8.0、9.0、10.0、11.0、12.0mL，摇匀后立即于沸水浴中加热10min，取出后迅速在流水中冲洗，冷却至室温，于490nm波长下测定吸光度值，测定结果见图3。由图可知，随着蒽酮添加量的增多，吸光度先升高后降低，在蒽酮添加量达到10mL时，吸光度为0.733，达到最大值，说明蒽酮溶液添加量为10mL时，多糖脱水生成的糠醛或其衍生物，与蒽酮反应完全，由此可知，蒽酮硫酸加入量应选择在10mL为宜。

（3）硫酸浓度对测定结果的影响

分别吸取2.0mL样品于25mL具塞试管中，分别加入以80%、85%、90%、95%、100%的硫酸为溶剂配制成3.0g·L^-1的蒽酮溶液，混匀后于沸水浴加热10min，取出后迅速在流水中冲洗，使其冷却至室温，于490nm波长下测定吸光度值，测定结果见图4。由图可知随着硫酸浓度的升高，吸光度值逐渐升高。当硫酸浓度为90%时，吸光度为0.744，达到最高值；当硫酸浓度超过90%后，吸光度逐渐平稳，说明在硫酸浓度为90%时，多糖在此条件下脱水完全；若酸不足，则多糖不能完全脱水；过酸条件下会使显色的物质分解，由此可知，硫酸浓度应选择在90%为宜。

（4）显色时间的选择

分别吸取2.0mL样品于25mL具塞试管中，分别加入浓度为3.0g·L^-1的蒽酮溶液10mL，混匀后于沸水浴加热2、5、10、15和20min，取出后迅速在流水中冲洗，使其冷却至室温，于490nm波长下测定吸光度值，测定结果见图5。由图可知，随着水浴时间的增加，吸光度值先升高后降低，当水浴时间达到10min时，吸光度达到最大值0.739；继续加热，吸光度反而下降。原因可能是加热时间过长，多糖的结构被破坏，有效成分降解，从而造成损失，所以水浴时间不宜过长。

3、正交试验设计试验结果

在单因素试验结果的基础上，确定蒽酮浓度为3.0g·L^-1，不选入优化试验。选择蒽酮添加量（A）、硫酸浓度（B）、水浴时间（C）三个因素进行优化。利用正交试验设计，选用L₉（3⁴）正交试验设计表进行优化，试验设计和结果见表1，方差分析结果见表2。

由表1和表2可知，试验设计所用三个因素中，对蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖的吸光度值的影响主次顺序为A＞D＞B，即蒽酮添加量＞显色时间＞硫酸浓度。蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖的最佳条件为浓度为3.0g·L^-1的蒽酮添加量为10mL，硫酸浓度为90%，显色时间为10min。在此组合下进行验证试验，秋葵多糖吸光度值平均值达到0.756，优于试验设计表中的最高得分，由此确定蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖的测定条件为3.0g·L^-1的蒽酮添加量为10mL，硫酸浓度为90%，沸水浴显色时间为10min，检测波长为490nm。

4、标准曲线的绘制

分别准确移取2mL系列标准溶液于25mL具塞试管中，以2mL蒸馏水为空白，在优化所得蒽酮-硫酸法的最优条件，测定葡萄糖系列标准溶液的吸光度值，以葡萄糖浓度和吸光度值的数据绘制标准曲线，结果见图6，标准曲线方程为y=4.22236x+0.0037，单位为mg·mL^-1，相关系数R²=0.9996。

5、换算因子的测定结果

在优化后的蒽酮硫酸法测定条件下，于490nm波长下平行测定三组秋葵精制多糖溶液的吸光度值，按回归方程计算出葡萄糖含量为：0.166mg·mL^-1，将其带入公式1中，计算出换算因子f=1.20。

6、精密度试验结果

精密度试验是指对同一秋葵多糖样品，采用完全一致的测定条件，得到的多个结果之间相互符合的程度。相对标准偏差越小，表示多次测定后的样品所得结果之间越相近，则精密度越高。依据精密度试验所得的秋葵多糖含量4.96%、4.99%、4.96%、4.93%、4.90%和4.90%，计算得出相对标准偏差为0.73%，说明优化后的该方法精密度较高，可以用于秋葵多糖的测定。

7、秋葵多糖含量的测定结果

将秋葵样品在优化后的蒽酮硫酸条件下平行测定3次，其在490nm波长下测得吸光度值，由公式2计算得出秋葵多糖的含量分别为4.96%、4.90%和4.99%，平均值为4.95%，与张红瑞等人的实验结果相近。

三、结论

本文优化了蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖的检测条件，并确定了换算因子。考察蒽酮浓度、硫酸浓度、蒽酮硫酸加入量和水浴时间对测定效果的影响，利用正交优化试验确定蒽酮法测定秋葵多糖的最优测定条件。试验得最优测定条为蒽酮浓度3.0g·L^-1、硫酸浓度90%、蒽酮硫酸加入量10mL、显色时间10min，在此条件下达到最优效果，并确定了换算因子为1.20，精密度RSD为0.73%。在此条件下，测得秋葵多糖含量为4.95%。该方法操作较简单、精密度高、结果证明在此条件下，利用蒽酮-硫酸法测定秋葵多糖含量具有操作简便、精密度高、测定成本低，设备要求低，适合于一般秋葵企业使用。

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