LC-MS法测定塞来昔布中2个苯肼类基因毒性杂质（一）

目的：建立液相色谱-质谱(LC-MS)法测定塞来昔布中对肼基苯磺酰胺(SHH)和对甲苯腙基苯磺酰胺(MAP) 2个苯肼类基因毒性杂质。方法：采用Thermo BDS Hypersil C18(100 mm×4.6 mm，2.4μm)色谱柱，以0.1%甲酸铵-0.1%甲酸水溶液∶甲醇(90∶10)溶液为流动相A，以甲醇为流动相B进行线性梯度洗脱。样品中加入5%二巯基苏糖醇的醋酸铵缓冲液作为稳定剂，在质谱电喷雾正离子化多反应监测模式下，以内标法进行定量测定。结果：SHH和MAP在20～200 ng·mL^-1浓度范围内线性关系良好；平均回收率分别为99.7%(RSD=6.0%，n=9)和97.6%(RSD=5.1%，n=9)。检测限为10 ng·mL^-1，定量限为20 ng·mL^-1，对照溶液和供试品溶液于4℃进样盘放置4 h内稳定。结论：本实验建立的LC-MS测定法适用于塞来昔布中SHH和MAP 2个苯肼类基因毒性杂质的检测。

塞来昔布(celecoxib)化学名为4-[5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺，特异性抑制环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2)，阻止炎性前列腺素类物质产生，临床用于治疗风湿性关节炎和骨关节炎等疾病。

基因毒性杂质(genotoxic impurity)是指可能具有遗传毒性的一类物质。在研究药物中基因毒性杂质时，应全面考虑药物的合成工艺和纯化流程等，充分考虑可能引入的基因毒性杂质。塞来昔布的合成工艺中，对肼基苯磺酰胺[(4-sulfamoylphenyl) hydrazine，SHH]是药物合成的中间体；4，4，4-三氟-1-(4-甲苯基)-1，3-丁二酮与SHH反应生成塞来昔布，SHH还可能与反应中间体对甲基苯乙酮反应，生成对甲苯腙基苯磺酰胺[(4-methyl-acetophenone) para-sulfonamide phenylhydrazine，MAP]。因此，在塞来昔布合成工艺中，可能涉及SHH和MAP2个苯肼类杂质。肼是已知的基因毒性杂质，具有潜在致癌性，SHH和MAP属于苯肼类基因毒性杂质，需对塞来昔布原料药中这2个杂质进行限度检查。

欧洲EMEA和美国FDA均提出采用“毒理学关注阈值”(threshold of toxicological concern，TTC)作为基因毒性杂质的可接受限度。2010年EMEA在基因毒性杂质限度计算方面指出，TTC值1.5μg·d^-1是应用在不同结构杂质的限度。结构相同或相似的基因毒性杂质，它们可能具有相同的作用模式或靶点，故该类杂质总量应不超过1.5μg·d^-1。SHH和MAP化学结构式如图1所示，均为肼类基因毒性杂质，所以各杂质的限度均设置为0.75μg·d^-1。

关于肼类杂质的测定方法：徐秀兰采用HPLC法测定塞来昔布中的SHH，限度为500 ng·m L^-1，灵敏度达不到本研究的要求；Vijaya等采用LC-MS法测定肼类杂质，条件探索时发现2个苯肼杂质在水溶液中极不稳定；Raman等采用苯甲醛衍生化，LC-MS法测定肼类杂质；Oh等采用苯二甲醛衍生化及GC-MS法测定肼类杂质。衍生化结合LC-MS或GC-MS法的灵敏度均较高，但是操作繁琐、涉及的试剂毒性较大。采用处理方法简单、高灵敏高专属的LC-MS法测定肼类杂质的报道较少。本研究建立塞来昔布中SHH和MAP 2个肼类杂质快速、便捷、高灵敏度的测定法，为肼类基因毒性杂质测定提供新的思路和方法，报道如下。

材料

1 仪器

Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪(配有在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱和Chromeleon工作站，美国Thermo Fisher Scientific公司)；TSQ Quantum Ultra(EMR)三重四极杆质谱仪(配有LC-quan 2.9QF1定量处理软件，美国Thermo Fisher Scientific公司)；BDS Hypersil C18色谱柱(100 mm×4.6 mm，2.4μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)；BS 21S分析天平(德国Satrious公司)；5424R台式高速冷冻离心机(美国Eppendorf公司)；Milli-Q Integral 5超纯水系统(美国Millipore公司)。

2试药和试剂

塞来昔布原料药(南京亿华药业有限公司，批号：120701，120702，120703，纯度：>99.0%)；SHH和MAP标准品(南京亿华药业有限公司，纯度均为99.0%)；乙腈、甲醇(美国TEDIA公司，色谱纯)；醋酸铵、甲酸、氨水(南京化学试剂有限公司，分析纯)；二巯基苏糖醇(上海麦克林生化科技有限公司，纯度为99%)；卡马西平对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100142-201004，纯度为99.5%)；自制去离子水。

方法与结果
1 液相色谱-质谱条件

1.1 液相色谱条件

采用Thermo BDS Hypersil C18(100 mm×4.6 mm，2.4μm)色谱柱；以0.1%甲酸铵-0.1%甲酸水溶液∶甲醇(90∶10)为流动相A，甲醇为流动相B；线性梯度洗脱(A∶B)：0 min (60∶40)→1.5 min (60∶40)→2.0 min(15∶85)→5.5 min(15∶85)→5.6 min(60∶40)→7 min(60∶40)。柱温为45℃，进样量为10μL，流速为0.65 m L·min^-1，柱后分流(6∶4)进行LC-MS/MS测定。

1.2 质谱条件

电喷雾正离子化(ESI+)测定2个苯肼基因毒性杂质，质谱参数如下：喷雾电压为4.5 k V，雾化温度为200℃，毛细管温度为350℃，辅助气压力为276 k Pa，鞘气压力为70 k Pa。三重四极杆质谱MRM模式检测，SHH：m/z 170.9→m/z 90.1，碰撞能量为17 e V；MAP：m/z 304.1→m/z 209.1，碰撞能量为20 e V；内标：m/z 237.11→m/z 194.10，碰撞能量为25 e V。

2 溶液制备

2.1 二巯基苏糖醇醋酸铵缓冲液

5 mmo L·L-1二巯基苏糖醇的1%醋酸铵缓冲液，氨水调节p H至8～9。

2.2 杂质对照溶液

精密称定SHH，MAP和内标卡马西平各约10 mg，分别置于100 m L量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 m L中各约含0.1 mg的杂质对照品储备液。精密移取SHH和MAP对照品储备液各约500μL、内标储备液约50μL，置于同一10 m L量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 m L中含SHH和MAP均约为5μg、内标为500 ng的混合工作溶液(现配现用)。取甲醇500μL置于2 m L离心管中，加入二巯基苏糖醇的醋酸铵缓冲液约20μL，精密移取杂质混合溶液20μL于离心管中，摇匀，再精密加入纯净水500μL，即得每1 m L中含SHH和MAP均约为100 ng，内标为10 ng的溶液，作为杂质对照溶液。

2.3 供试品溶液

精密称定塞来昔布原料药约80 mg，置于2 m L离心管中，加入甲醇(氨水碱化)500μL，振摇使溶解，加入二巯基苏糖醇的醋酸铵缓冲液约20μL，摇匀；精密加入内标工作溶液(500ng·m L^-1) 20μL，摇匀，再加入纯净水约500μL，振摇，析出塞来昔布。15 800 r·min^-1低温(4℃)离心10 min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

3 专属性试验

在所建立的测定条件下，SHH和MAP 2个杂质的保留时间分别为1.76和4.66 min，2个待测物完全分离，峰形良好，LC-MS色谱图见图2。可见空白溶剂和供试品溶液对测定无干扰。

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