LC-MS法测定塞来昔布中2个苯肼类基因毒性杂质（二）

4标准曲线

精密量取“2.2”项下各杂质储备液适量，制成内标均为10ng·mL^-1、SHH和MAP的质量浓度均分别约为20，30，50，100，150和200ng·mL^-1(各相当于限度浓度的20%，30%，50%，100%，150%和200%)的系列浓度梯度的溶液，按照“1”项下条件分别进行测定，记录色谱图。以待测物峰面积(Ax)和内标峰面积(Ai)比值R(Ax/Ai)对浓度(C)进行线性回归。SHH和MAP浓度在20～200ng·mL^-1的范围内，峰面积比值和进样浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程分别为R=0.0001223C-0.001020(r=0.9964)和R=0.005607C-0.01234(r=0.9998)。

5检测限和定量限

根据《中华人民共和国药典》2015年版通则9101中“响应值标准偏差和标准曲线斜率法”计算，2个杂质的检测限约为10ng·mL^-1，定量限约为20ng·mL^-1。按照“2.2”项下方法，配制定量下限测试溶液6份，分别进样分析，测定结果带入标准曲线回算。SHH和MAP定量下限的测定浓度与理论浓度的偏差<20%，测定浓度的RSD(n=6)分别为13.4%和1.7%，符合测定的灵敏度和精密度要求。

6加样回收率试验

按照“2.2”项下配制2个待测物低、中、高浓度(2.5，5.0，7.5μg·mL^-1)和内标(500ng·mL^-1)的混合工作液，作为加样回收率试验工作液。取已测定SHH和MAP基因毒性杂质(含量均未检出)的塞来昔布供试品约80mg，精密称定，置于2mL离心管中，精密加入甲醇500μL，振摇使完全溶解，加入“2.1”项下二巯基苏糖醇的醋酸铵缓冲液约20μL，摇匀；精密加入SHH和MAP的加样回收率试验工作液20μL，摇匀，再加入纯净水约500μL，制得低(50%)、中(100%)、高(150%)浓度的加样回收率试验溶液，每个浓度样品平行制备3份；按照“2.2”和“2.3”项下方法制备供试品溶液和杂质对照溶液。按照“1”项下方法分别进样测定，记录色谱图。按照内标法以峰面积比计算SHH和MAP的测得质量浓度，并分别计算SHH和MAP的回收率，结果见表1。SHH与MAP的平均回收率分别为99.7%(RSD=6.0%，n=9)和97.6%(RSD=5.1%，n=9)，表明本法准确度良好。

7精密度试验

取“2.2”项下限度浓度杂质对照溶液，连续进样6次，计算2个杂质峰面积和内标峰面积比值的RSD(n=6)分别为2.8%和1.7%，表明仪器进样精密度良好。

8重复性试验

按照“6”项下方法制备“中浓度”的加样供试液6份，按照“1”项下方法分别测定，2个杂质峰面积和内标峰面积比值的RSD(n=6)分别为4.5%和2.0%，方法符合测定的精密度要求。

9稳定性试验

9.1进样盘(4℃)稳定性

按照“6”项下方法制备低、高浓度的加样供试液和不加样的低、高浓度的对照溶液。分别在0和4h，按照“1”项下方法分别进样测定，记录色谱图。计算2个杂质峰面积同内标峰面积比值的RSD(n=6)，4组RSD均<10%，表明该处理条件下的4h内稳定性良好，可满足分析批测样要求。

9.2杂质对照品储备液(-20℃)稳定性

取“2”项下的方法将新鲜配制的各杂质对照品储备液及-20℃冰箱储存9d的各杂质对照品储备液适量，分别制成SHH和MAP为100ng·mL^-1，内标为10ng·mL^-1的混合对照溶液各3份，按照“1”项下方法分别进样测定，记录色谱图。各对照品峰面积和称样量重量比值的RSD(n=6)均<10%，表明杂质储备液在-20℃条件下存放9d稳定性良好。

10样品测定

按照“2”项下方法分别配制杂质对照溶液和供试品溶液，按照“1”项下的条件分别测定，记录色谱图。按内标法以峰面积的比值计算供试品中SHH和MAP的含量，结果如图2-C所示。3批待测样本中SHH和MAP基因毒性杂质均未检出。

讨论

在色谱柱选择时，分别考察了ThermoBDSHypersilC18(100mm×4.6mm，2.4μm)、InsertsilODS-SP(250mm×4.6mm，5μm)、PhenomenexCuroSil-PFP(250mm×4.6mm，5μm)和WatersSymmetryC18(150mm×3.9mm，5μm)色谱柱。2个待测物在BDSHypersilC18色谱柱上均有较佳的峰型，且各峰分离度良好。在流动相选择时，分别考察甲醇、乙腈和甲醇-乙腈3种体系的流动相，流动相为乙腈时，各检测通道无干扰；流动相为甲醇时，检测通道有较小干扰，但待测物的响应较乙腈体系中增加约10倍。最终选用甲醇为流动相的体系，以满足样品分析的灵敏度要求；同时在流动相中添加一定量的甲酸，可增加待测物的质谱响应，加入适量乙酸铵能够有效改善待测物的色谱峰型。

按照“6”项下条件，制备塞来昔布添加限度浓度对照溶液(未加稳定剂)，SHH在连续6次进样分析中，峰面积的RSD(n=6)超过50%。参考文献显示苯肼类物质多数使用衍生化方法测定，原因可能是苯肼类化合物在溶液中极易氧化降解，溶样液(50%甲醇)测得其表观pH显酸性，苯肼类杂质在酸性条件下更易发生氧化反应。选择抗氧化剂可以有效增加该类化合物的稳定性，二巯基苏糖醇是一类常用的抗氧化剂，当pH在8～10之间时能发挥较好的抗氧化作用。最终优化的条件为:溶解样品的甲醇先用氨水碱化pH至8～9，各样品在处理时加入适量5mmoL·L^-1二巯基苏糖醇溶液(1%醋酸铵缓冲液)，保持溶液在碱性环境，使二巯基苏糖醇发挥最大的抗氧化作用。经测试加入抗氧化剂二巯基苏糖醇和调节溶样液pH后，苯肼杂质的溶液在4h内稳定，满足分析批样品测定的要求。

塞来昔布易溶于甲醇和乙腈，在甲醇中溶解度约为180mg，水中几乎不溶。限度浓度供试品溶液中塞来昔布的浓度为80mg·mL^-1，80mg塞来昔布可完全溶解于1mL甲醇中，但是在甲醇和水的混合体系中不能完全溶解。在测定供试品中基因毒性杂质时，首先应选择适宜的溶剂完全溶解供试品，使得潜在的基因毒性杂质完全释放、溶解，保证测定结果准确、可靠；同时考虑溶样液和流动相匹配的原则、高浓度的供试品会污染离子源或引起基质效应、液相分离时高浓度基质易使色谱柱过载或析出等因素。综合以上考虑，在供试品完全溶解的前提下，结合基质钝化法等方法，除去供试液中大部分的塞来昔布。

综上所述，本研究采用LC-MS法测定塞来昔布中SHH和MAP2个苯肼类基因毒性杂质，方法灵敏度高、专属性好。采用特定的溶样方式，去除高浓度塞来昔布样品干扰；二巯基苏糖醇的应用解决了肼类杂质水溶液不稳定的问题。该方法样品前处理简单方便，已成功应用于塞来昔布中2个苯肼类基因毒性杂质的分析检测，为其质量控制提供保障，同时也为药物中微量肼类杂质的检测提供了新的方法。

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