猪肉和鸡肉中11种同化激素残留超高效液相色谱-串联质谱法测定（一）

同化激素是一类具有强的蛋白质同化作用，可抑制异化或氧化代谢，提高蛋白质沉积的甾体类物质，具有重要的残留毒理学意义。在养殖业滥用最普遍的主要有睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、康力龙、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等。由于它们能提高饲料转化率和瘦肉生产率，一些从业者在利益驱使下将其用作畜禽的促生长剂。雄性激素可损害人的肝功能，影响心血管系统，伤害人体的生殖系统，引起内分泌功能障碍等，过量摄入性激素还可能对青少年的神经系统和心理行为发展造成不可逆转的损害。原农业部发布的第178号公告明确指出不得在动物饲料和饮食中添加苯丙酸诺龙等药物。但目前非法将这类药物用于畜禽、水产养殖上的报道仍时有发生。

国内外主要采用液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法检测动物组织中的睾酮、甲睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等同化激素。目前我国对于上述11种同化激素在猪肉、鸡肉中的多残留检测报道相对较少，参考现有的行业标准(农业部1031号公告-1-2008[14]),本研究在参考文献基础上对仪器参数和样品前处理条件进行优化，拟建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS),以期能够同时测定鸡肉、猪肉中睾酮等11种同化激素，为批量检测样品中睾酮等违禁药物的残留量提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物

睾酮、甲睾酮、群勃龙、诺龙、美雄酮、丙酸诺龙标准品，德国Dr.Ehrenstorfer公司产品；勃地龙，美国CATO公司产品；丙酸睾酮、康力龙、黄体酮，中国食品药品检定研究所产品；苯丙酸诺龙标准品，美国IL公司产品。

1.1.2 试剂

甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯，德国Merk公司产品；乙酸乙酯、叔丁基甲醚、无水乙醇均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色谱系统，美国安捷伦公司产品；Triple QuadTM4500液质联用仪，AB SCIEX公司产品，配Analyst1.6.3软件；CPA225D电子天平，赛多利斯科学技术仪器(北京)有限公司产品；ST16R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司产品；JE1002电子天平，上海浦春计量仪器有限公司产品；R205B旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司公司产品；N-VEVAP 24位氮吹仪，美国Organomation公司产品；MS3普通型旋涡混合器，广州仪科实验技术有限公司产品；Milli-Q Reference超纯水系统，Merck Millipore公司产品；WAT200677固相萃取装置，Waters公司产品；Agilent C18固相萃取小柱(200 mg, 3 mL),美国安捷伦公司产品。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

1.2.1.1 同化激素标准储备溶液配制

准确称取睾酮、甲睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、康力龙、丙酸诺龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙10 mg(按实际含量折算，精确至0.0001)置于10 mL容量瓶中，用纯甲醇溶液溶解并稀释，配成1 mg/mL标准储备溶液，置-20℃下保存。

1.2.1.2 同化激素混合标准中间液的配制

从配制好的同化激素标准储备液中，各自取1.0 mL的同化激素标准储备液，甲醇定容至20 mL,配制成50 μg/mL的混标储备液，置-20℃下保存。用甲醇稀释备用。

1.2.2 色谱与质谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq(2.1 mm×150 mm, 3.5 μm);流动相：A相为0.1%甲酸乙腈，B相为0.1%甲酸水溶液；柱温：37℃;进样体积：5 μL;流速：0.25 mL/min; 梯度洗脱程序：0 min～1 min, 30%～55% A;1 min～3 min, 55% A;3 min～6 min, 55%～98% A;6 min～12 min, 98% A;12 min～12.5 min, 98%～30% A;12.5 min～15 min, 30% A。质谱条件：电喷雾电离(ESI),正离子扫描，多反应监测模式(MRM);电喷雾电压(IS)5500V,雾化气压力(GSl)65 psi, 辅助器流速(GS2)60 L/rain, 气帘气压力(CUR)30 psi, 离子源温度(TEM)550℃,碰撞室压力(CAD)8 psi。去簇电压、碰撞能量及定量离子对、定性离子对等参数见表1。

1.2.3 样品测定

1.2.3.1 样品制备

将鸡肉、猪肉的可食用组织部分尽可能地去除筋膜和脂肪后，切成小块，用绞肉机绞碎，置-20℃下保存备用。

1.2.3.2 样品提取

精确称取2 g(精确至0.001 g)匀浆好的组织于50 mL 聚丙烯离心管中，加入10 mL 甲醇-乙腈(1∶1,v/v),涡旋混匀，超声提取10 min, 以6000 r/min 离心10 min。将上清液转移至50 mL 聚丙烯离心管中，重复提取一次。合并提取液，置-20℃下，冷冻2 h。以10000 r/min, 离心10 min。

1.2.3.3 样品净化

将“1.2.3.2”中提取的上清液于37℃水浴旋转蒸至近干，加4 mL 30%乙腈水溶解，备用。将上述溶液加到C18固相萃取柱净化(3 mL甲醇、3 mL水活化，6 mL 30%甲醇水淋洗),抽干后，加入4 mL乙腈洗脱，置-20℃下冷冻1 h。以15000 r/min, 离心10 min。于37℃水浴下氮气缓慢吹干。加入1 mL 30%乙腈复溶，涡旋2 min, 上清液过0.22 μm滤膜，待测。

1.2.3.4 检测限与定量限的测定

分别制备0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2 μg/kg的添加样品，每个浓度重复3次，前处理后。经UPLC-MS/MS检测，从基质添加样品中检测待测物质的最小浓度为检测限(limit of detection, LOD),被定义为信噪比S/N≥3。根据其检测限以同样的方法确定其定量限，基质添加样品中被测物能被定量测定的最低量为定量限(Limit of Quantitation, LOQ),被定义为S/N≥10。

1.2.3.5 标准曲线的制作

准确称取空白样品7份，进行前处理，制备空白基质液。将混合标准储备液用初始流动相稀释成1000、500、200、100、50、20、10 ng/mL的标准工作液。取空白基质液对上述标准工作液进行稀释，制得浓度为100、50、20、10、5、 2、1 μg/kg的空白基质匹配标准溶液，每个浓度重复3次，共做3个批次。

1.2.3.6 回收率与精密度

准确称取2 g(精确至 0.001 g)空白基质，添加适当浓度的混合标准工作液 100 μL,制备成10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg的添加浓度。每个添加浓度做5个重复，连续做3个批次，添加提取剂进行提取，其他按照上述前处理方法进行处理。同时制得10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg的空白基质匹配标准溶液，采用单点定量法，按照回收率计算公式计算各添加水平下的回收率。每组5个平行样品回收率之间的相对标准偏差是批内精密度(RSD),3个批次的添加样品回收率之间的相对标准偏差是批间精密度(RSD)。

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